內質網(wǎng)應激在新型亞臨床甲減小鼠模型脂代謝紊亂中的作用研究.pdf

1、目的:
　　亞臨床甲狀腺功能減退癥，簡稱為亞臨床甲減或者亞甲減(SCH)，是一種臨床上較為常見的隱匿性甲狀腺疾病。本研究首先使用抗甲狀腺藥物他巴唑(MMI)成功建立了一種新型亞臨床甲減小鼠型（SCH模型），然后評估了SCH模型小鼠全身代謝情況和脂代謝情況，在此基礎上又觀察了SCH模型小鼠肝臟ER stress反應，最后對ER stress在亞甲減脂代謝紊亂中的可能作用機制進行了探討。
　　1.建立一種新型的SCH小鼠模型。<

2、br>　　2.評估SCH模型小鼠的全身代謝相關情況和脂代謝情況。
　　3.評估亞SCH模型小鼠是否存在肝臟ER stress反應。
　　4.探討ER stress與SCH模型小鼠脂代謝的相關關系。
　　方法:
　　1.SCH模型小鼠建立方法:應用常用抗甲藥物MMI（0.08 mg/kg）飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠，創(chuàng)立新型的SCH模型小鼠。MMI喂養(yǎng)12周，16周和20周時，采用I125標記放射免疫方法檢測小鼠的

3、血清游離甲狀腺素(FT4)和游離三點原氨酸(FT3)水平;采取Elisa的方法測驗小鼠血清TSH情況評估小鼠的血清甲狀腺功能。并檢測血清谷丙轉氨酶(ALT)和血清谷草轉氨酶(AST)評估小鼠肝臟功能。
　　2.代謝情況評估:用TSE PhenoMaster動物代謝測量分析系統(tǒng)（簡稱為動物代謝籠系統(tǒng)）評估小鼠的物理活動度、產熱情況、二氧化碳產量(VCO2)、耗氧量(VO2)、呼吸商(RQ)、飲食和基礎代謝率(BMR)等全身代謝情況。

4、
　　3.脂代謝情況檢測:檢驗科檢測小鼠血脂;組織膽固醇含量分析試劑盒和組織甘油三酯含量分析試劑盒檢測小鼠肝臟組織脂質（膽固醇和甘油三酯）含量;菲律賓(Filipin)染色評估小鼠肝組織膽固醇積聚狀況;油紅O染色評估小鼠肝組織脂質積聚狀況。Real-time PCR的方法檢測小鼠重要臟器——肝臟的脂質合成及脂代謝樞紐分子的表達狀況。
　　4.小鼠肝臟內質網(wǎng)應激情況檢測:采取Western Blot法測驗肝臟ER stress

5、三條通路蛋白的表達狀況:Bip的蛋白變化，磷酸化IRE1α和總IRE1α的蛋白水平變化，XBP1u（未剪接體形式）和XBP1s（剪接體形式）的蛋白水平程度變化，磷酸化的eif2α和總eif2α蛋白水平的變化，以及ATF6α的蛋白水平變化。
　　5.細胞培養(yǎng)驗證:不同濃度梯度的TSH和陽性對照衣霉素（TM，ER stress激動劑）培養(yǎng)HepG2細胞株6小時，觀察TSH對HepG2細胞的直接作用，能否導致細胞ER stress反應。

6、采取Western Blot法檢驗細胞中Bip的表達程度變化，磷酸化IRE1α和總IRE1α的表達程度變化，XBP1u（未剪接體形式）和XBP1s（剪接體形式）的表達程度變化。
　　6.4-PBA改善SCH模型小鼠的脂代謝紊亂:4-苯基丁酸（4-PBA，內質網(wǎng)應激的化學阻斷劑）注射亞臨床甲減小鼠4周后，評估各組小鼠肝臟ER stress的情況，同時檢測相關脂代謝情況和脂質代謝相關基因的表達情況。
　　結果:
　　1.S

7、CH小鼠模型的建立:0.08 mg/kg·d MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠分別造模12周，16周，20周時，取血檢驗小鼠血清甲功指標。發(fā)現(xiàn)在MMI喂養(yǎng)小鼠12周時，模型組小鼠血清FT4、FT3測值與對照組小鼠相比無明顯差異性的變化(P＞0.05);血清TSH水平模型組明顯高于對照組小鼠(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。上述變化符合亞臨床甲減的臨床特點和診斷標準，說明在MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6小鼠12周時，已經(jīng)建立成了SCH模

8、型。MMI喂養(yǎng)16周時，模型組小鼠仍然保持著亞臨床甲減的狀態(tài)。而在MMI喂養(yǎng)20周時，模型組小鼠血清FT4水平明顯低于對照組小鼠(P＜0.05)，說明模型組小鼠進入臨床甲減狀態(tài)。MMI造模時，模型組小鼠亞甲減狀態(tài)大約持續(xù)8周。
　　2.SCH模型小鼠全身代謝情況評估:選用MMI喂養(yǎng)16周SCH模型小鼠，放入代謝籠系統(tǒng)監(jiān)測其全身代謝情況。發(fā)現(xiàn)與對照組對比后，SCH模型小鼠的活動度、VCO2、VO2、RQ、產熱量和BMR均無明顯不同(

9、P＞0.05)。這與亞甲減病人臨床特征相符:與甲狀腺機能正常人對比，無明顯代謝差異，不表現(xiàn)出明顯的低代謝特點。
　　3.SCH小鼠脂質代謝紊亂:與對照組相比，MMI喂養(yǎng)12周SCH模型小鼠的血脂譜和肝臟TC含量無顯明差異;但此時肝臟甘油三酯含量增加(P＜0.05);肝組織切片油紅O染色亦表明5CH模型小鼠脂質積聚較對照組增長。與對照組對比后發(fā)現(xiàn)，MMI喂養(yǎng)16周SCH模型小鼠血清TC，LDL-C和TG水平均有統(tǒng)計學意義地增長(P＜

10、0.05);肝臟膽固醇含量(p＜0.05)和肝臟甘油三酯含量(p＜0.05)均明顯增加;菲律賓(Filipin)染色和油紅O染色結果也與上述數(shù)據(jù)相符合。PCR的結果顯示，在SCH模型小鼠中，肝臟膽固醇合成關鍵基因SREBP2、HMGCR表達增高(P＜0.05)而膽固醇轉化主要因子CYP7A1、HNF4α的表達下降(P＜0.05);肝甘油三酯合成代謝關鍵基因SREBP1C和PPARα的mRNA表達上升(P＜0.05)，脂肪酸氧化限速酶CP

11、T1α表達同樣增強(P＜0.05)。
　　4.肝細胞ER stress情況評估:SCH模型小鼠肝臟Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s（剪接體形式）的蛋白表達皆比對照小鼠組顯明增長(P＜0.05)，而其他通路中關鍵分子則無明顯變化。說明亞臨床甲減能夠激發(fā)小鼠肝臟ERstress，且可能主要是通過激發(fā)IRE1α/XBP1 s通路起作用。為了進一步說明ER stress是由TSH升高導致的，本研究又采用不同濃度TSH刺激Hep

12、G2細胞同時選用TM作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)TSH刺激HepG2細胞6小時后，Bip、磷酸化IRE1α、及其下游XBP1s的蛋白表達均較對照組明顯增加(P＜0.05)，且對于此種刺激作用存在有顯著劑量依賴性的特點。
　　5.ER stress有可能于亞臨床甲減中的脂代謝紊亂中施展樞紐作用:應用ERstress阻斷劑4-PBA給SCH模型小鼠連續(xù)注射4周后，發(fā)現(xiàn)SCH模型小鼠的脂代謝紊亂狀態(tài)明顯改善:血脂調整至正常程度，肝臟TC含量和肝臟

13、TG含量也較未注射4-PBA的SCH小鼠顯著下降(P＜0.05)，肝組織切片的菲律賓(Filipin)染色和油紅O染色也與上述結果相一致。TG代謝和TC代謝的關鍵基因在分子轉錄水平也發(fā)生了相宜的程度變化。說明ER stress很可能在亞甲減伴隨的脂代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，當糾正了亞臨床甲減的ERstress后，脂代謝紊亂明顯改善。
　　結論:
　　1.應用MMI飲水喂養(yǎng)C57BL/6可以創(chuàng)立一種新型非侵入性、簡單易行的SCH