乙腦減毒活疫苗關(guān)鍵功能位點(diǎn)分析及相關(guān)病毒載體應(yīng)用研究.pdf

1、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），簡(jiǎn)稱乙腦病毒，是乙型腦炎（簡(jiǎn)稱乙腦）的病原體，主要流行在東南亞和太平洋地區(qū)，在全球范圍內(nèi)每年引起約68，000例乙腦病例，死亡約10，000例。乙腦病毒主要以三帶喙庫(kù)蚊為媒介在脊椎動(dòng)物宿主之間傳播。病毒感染嚴(yán)重危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，約有50％的幸存者患有伴隨終生的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年來(lái)，乙腦病毒引起的感染范圍正在擴(kuò)大。乙腦已成為世界上最嚴(yán)重的病毒性腦炎類疾病之一

2、，嚴(yán)重威脅人類健康。
　　疫苗接種是預(yù)防乙腦的有效手段。乙腦減毒活疫苗SA14-14-2于1989年在中國(guó)被批準(zhǔn)上市，已有超過(guò)3億兒童接種了該減毒活疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性與安全性，生產(chǎn)成本低，單次免疫即能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，而且免疫力持久。2013年，該疫苗株通過(guò)了世界衛(wèi)生組織疫苗生產(chǎn)預(yù)認(rèn)證，被推薦在世界范圍內(nèi)使用。但目前對(duì)乙腦活疫苗的減毒機(jī)制尚不完全清楚。
　　乙腦病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，是有

3、包膜的單股正鏈RNA病毒。其基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白[衣殼蛋白(C)、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）和包膜糖蛋白(E)]和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒吸附、侵入和組裝，非結(jié)構(gòu)蛋白主要負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制。研究表明，黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1能夠以細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞外分泌等多種形式表達(dá)，與病毒的復(fù)制、組裝以及宿主的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)密切相關(guān)。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，乙腦血清亞

4、組各成員在感染過(guò)程中還表達(dá)一種NS1相關(guān)蛋白NS1'，生物信息學(xué)分析顯示該蛋白是位于NS2A基因上程序性-1核糖體移碼的產(chǎn)物。目前，該血清亞組特有的NS1'蛋白在乙腦病毒致病過(guò)程中的表達(dá)及功能尚未明確。
　　另一方面，近年來(lái)乙腦病毒的流行范圍和分布區(qū)域發(fā)生了較大的改變?；颌裥筒《疽呀?jīng)逐漸取代原有的基因Ⅲ型病毒成為當(dāng)下主要的流行株，而現(xiàn)有的所有乙腦疫苗都來(lái)源于基因Ⅲ型病毒。有研究顯示，來(lái)源于Ⅲ型的滅活疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)其他基因型

5、病毒株的中和抗體能力明顯降低。乙腦減毒活疫苗對(duì)目前的Ⅰ型病毒流行株的保護(hù)作用是否受到影響尚有待研究，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)影響乙腦疫苗株保護(hù)效力關(guān)鍵的中和位點(diǎn)對(duì)乙腦的防控和治療具有重要的意義。
　　此外，乙腦疫苗株高度減毒，具有良好的安全性及免疫原性，因此有望發(fā)展為新的病毒類表達(dá)載體。
　　針對(duì)上述科學(xué)問(wèn)題，本研究首先對(duì)決定NS1'蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素以及NS1'蛋白在乙腦病毒致病過(guò)程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探討，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了影響乙腦疫苗

6、株誘導(dǎo)中和抗體效價(jià)的基因型特異中和位點(diǎn)，最后對(duì)該疫苗株表達(dá)外源基因的可行性和特性進(jìn)行了評(píng)估。
　　本研究主要包括三個(gè)部分:
　　一、乙腦病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中的毒力位點(diǎn)鑒定與分析
　　為尋找決定NS1'蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素及其對(duì)病毒毒力的影響，本研究將野生型乙腦病毒SA14與減毒疫苗株SA14-14-2感染BHK-21與C6/36細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)感染細(xì)胞中NS1與NS1'蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，SA14能夠

7、在感染細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)2種形式的NS1蛋白，而在SA14-14-2感染細(xì)胞中僅能檢測(cè)到NS1蛋白的表達(dá)。
　　通過(guò)核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與JEV血清亞組的病毒分離株相比，在疫苗株SA14-14-2 NS2A基因第66位核苷酸存在一個(gè)沉默突變(G→A)，稱為G66A。對(duì)乙腦病毒基因組相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，G66A核苷酸突變影響了位于NS2A基因上的假結(jié)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而該假結(jié)結(jié)構(gòu)是NS1'蛋白形成的必要條件。
　　為證實(shí)該沉

8、默突變對(duì)NS1'蛋白表達(dá)及病毒毒力的影響，我們?cè)谝夷X病毒SA14全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上引入G66A核苷酸突變，拯救獲得攜帶該突變的恢復(fù)病毒(G66A)。評(píng)價(jià)SA14與突變病毒G66A感染細(xì)胞中NS1相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與SA14相比，G66A喪失了NS1'蛋白的表達(dá)能力而只能表達(dá)NS1。隨后，通過(guò)比較SA14與G66A突變病毒在小鼠模型上的致病性發(fā)現(xiàn)，突變病毒G66A的神經(jīng)毒力與神經(jīng)侵襲力均明顯弱于SA14，且在鼠腦中的增殖能力也低于S

9、A14。
　　上述研究結(jié)果表明，乙腦病毒NS2A的第66位核苷酸突變G66A影響了假結(jié)結(jié)構(gòu)依賴的移碼，進(jìn)而抑制了NS1'蛋白的表達(dá)，是乙腦病毒的一個(gè)新的關(guān)鍵毒力位點(diǎn)。
　　二、乙腦病毒基因型特異中和位點(diǎn)的鑒定與分析
　　為了分析乙腦疫苗株對(duì)不同基因型病毒株的保護(hù)效力，本研究首先評(píng)價(jià)了16份減毒活疫苗免疫人血清樣品對(duì)疫苗株SA14-14-2以及乙腦病毒分離株FJ03、 SX06、SC04和SH53的中和效價(jià)。結(jié)果表明，免

10、疫血清對(duì)乙腦病毒分離株的中和效價(jià)要顯著低于疫苗株。
　　為進(jìn)一步分析影響中和抗體效價(jià)的關(guān)鍵因素，本研究對(duì)基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙腦病毒的E蛋白氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第222和327位氨基酸是基因型特異的氨基酸位點(diǎn)。進(jìn)一步利用反向遺傳學(xué)技術(shù)將A222S與S327T氨基酸突變引入到基因Ⅲ型乙腦病毒感染性克隆中，拯救攜帶相應(yīng)氨基酸突變的恢復(fù)病毒（A222S、S327T和A222S/S327T）。突變病毒的蛋白表達(dá)效率、蝕斑形態(tài)、體外增殖

11、特性和病毒毒力與野生型病毒相比無(wú)明顯差異，而蝕斑減少中和試驗(yàn)結(jié)果表明，乙腦疫苗SA14-14-2免疫血清對(duì)突變病毒的中和效價(jià)與野生型病毒相比有所降低，該結(jié)果表明A222S與S327T突變可能影響了減毒活疫苗免疫誘導(dǎo)的中和抗體效力。
　　本研究進(jìn)一步將相應(yīng)的氨基酸突變引入到乙腦減毒活疫苗中，并評(píng)價(jià)了突變疫苗株對(duì)基因Ⅰ型病毒分離株SX06和SH53的保護(hù)效力。結(jié)果顯示，攜帶A222S與S327T氨基酸單點(diǎn)突變的疫苗株免疫小鼠誘導(dǎo)的中和

12、抗體效價(jià)與原疫苗株相比較高，且突變疫苗株保持了較好的遺傳穩(wěn)定性與減毒特性，表明E蛋白中基因型特異氨基酸位點(diǎn)可能是乙腦病毒潛在的重要中和位點(diǎn)，將A222S與S327T氨基酸突變引入減毒活疫苗基因組中有助于提高其對(duì)基因Ⅰ型病毒流行株的保護(hù)效力。
　　三、基于乙腦減毒株的病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立與應(yīng)用
　　本研究以乙腦減毒株感染性克隆為基礎(chǔ)，通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)，將基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的結(jié)構(gòu)基因E

13、3-E2 DomainA片段與腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列引入乙腦病毒基因組C基因下游，并在CHIKV基因編碼區(qū)末端添加終止密碼子，構(gòu)建了攜帶CHIKV抗原基因的重組病毒感染性克隆。體外轉(zhuǎn)錄制備的相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠?qū)е碌湫偷募?xì)胞病變效應(yīng)，RT-PCR結(jié)果顯示外源基因被成功插入到乙腦病毒基因組中。重組病毒在BHK-21細(xì)胞上形成的蝕斑明顯小于乙腦減毒株，且在細(xì)胞上的增殖能力有所降低。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組病毒能夠有效表達(dá)C

14、HIKV外源蛋白。上述結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了攜帶CHIKV抗原基因的重組乙腦病毒，并證實(shí)了乙腦減毒株作為病毒載體的可行性，該表達(dá)系統(tǒng)為新型重組病毒類疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上，本研究以乙腦病毒感染性克隆為基礎(chǔ)，將生物信息學(xué)技術(shù)與反向遺傳學(xué)突變分析相結(jié)合，證實(shí)了乙腦減毒活疫苗SA14-14-2非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A中的G66A核苷酸突變破壞了假結(jié)結(jié)構(gòu)依賴的核糖體移碼，從而抑制了NS1'蛋白的表達(dá)，最終降低了病毒的神經(jīng)毒力