新型腺相關(guān)病毒載體及應(yīng)用研究.pdf

1、腺相關(guān)病毒載體在基因治療基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中得到越來越多的應(yīng)用。近年來，多種血清型以及外殼改造的AAV載體的發(fā)展更拓寬了其應(yīng)用價(jià)值和范圍。
　　本研究第一部分建立了以攜帶rep和cap基因的重組單純皰疹病毒作為輔助病毒的、多種血清型AAV載體的生產(chǎn)系統(tǒng)和方法，并成功地制備了攜帶報(bào)告基因的AAV1、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、AAV2/8m、AAV8等6種重組病毒，用點(diǎn)雜交方法測(cè)定了這些病毒的滴度，用SDS-PAGE方法

2、分析了它們的外殼蛋白組成和病毒純度。這部分研究為AAV病毒在基因治療等方面的應(yīng)用提供了新的選擇，也是為本文第二、三部分工作做準(zhǔn)備。
　　本研究第二部分創(chuàng)建了一種AAV載體“反向感染”陣列(AAV ReverseInfection Array，AAV RU array)方法，即將攜帶了報(bào)告基因或外源基因的rAAV病毒有序排列于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中形成一種陣列并晾干保存。該方法的意義在于可以簡(jiǎn)單方便地實(shí)現(xiàn)高通量的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，可用于在體外比

3、較不同血清型AAV對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、攜帶生物傳感器用于檢測(cè)細(xì)胞miRNA活性譜等方面的研究。
　　為了探索AAV反向感染的可行性，我們首先研究了96孔培養(yǎng)板上每孔AAV病毒的包被量以及加入的細(xì)胞數(shù)量范圍：其次篩選和優(yōu)化了AAV載體包被于細(xì)胞培養(yǎng)板上晾干保存的溶液配方，并評(píng)價(jià)了培養(yǎng)板上包被的AAV載體的熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，用適當(dāng)?shù)木彌_液可以將AAV病毒包被在細(xì)胞培養(yǎng)板上并且晾干而不失去活性，并且可以在4。C長期保存。之后，我們用AA

4、V砌array方法比較了不同血清型或外殼嵌合型AAV載體對(duì)多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將表達(dá)EGFP基因的6種AAV載體(包括AAVl、AAV2、AAV5/5、AAV2/5m、.AAV2/8m、AAV8載體)用AAV RI array方法體外感染16種細(xì)胞，其中包括12種貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞BHK21，HEK293，BEAS-2BS，C2Cl2，L02，Huh7，HepG2，Hepal-6，L/S-39，CT-26，A549，HeLaS3和4種懸浮培

5、養(yǎng)的細(xì)胞U937、K562、SP2/0、A20細(xì)胞。結(jié)果表明，AAV載體在對(duì)體外培養(yǎng)的不同細(xì)胞的感染效率有很大差異，BHK21、HEK293、U937、BEAS-2BS細(xì)胞的感染效率高，而CT-26、SP2/0、A20和L/S-39對(duì)各型AAV載體均不敏感；對(duì)于同一種細(xì)胞，不同型AAV載體的感染效率明顯不同，一般是AAV2>>AAV1>>其它AAV載體；HeLaS3細(xì)胞對(duì)AAV1的感染效率則高于AAV2；加丁酸鈉可以明顯提高AAV載體介

6、導(dǎo)的基因表達(dá)，尤其是對(duì)于AAV2載體的增強(qiáng)效果最顯著，其次是AAV1；AAV8載體對(duì)體外培養(yǎng)的各種細(xì)胞的感染效率都遠(yuǎn)不如AAV2和AAV1。
　　在上述工作基礎(chǔ)上，我們嘗試將AAV RI Array方法應(yīng)用于細(xì)胞miRNA活性的檢測(cè)，建立了一種新的細(xì)胞中miRNA活性譜檢測(cè)方法。構(gòu)建了一系列由AAV2載體攜帶的miRNA活性檢測(cè)傳感器(Asensor)，并利用AAV RI Array方法將其制備成Asensor陣列，并用其檢測(cè)了A

7、549、Huh7、HEK293、HeLaS3、K562和BEAS-2BS等細(xì)胞株中miRNA的活性譜。初步研究結(jié)果令人鼓舞，顯示了這種方法良好的的可行性和應(yīng)用潛力。
　　本研究第三部分嘗試用AAV8為載體研制HBV小鼠模型。制備了一種攜帶1.3拷貝HBV(ayw亞型)基因組的重組AAV8病毒rAAV8-HBV1.3，經(jīng)尾靜脈注射到3只C57BL/6小鼠體內(nèi)。一周開始在血液中檢測(cè)到HBsAg和HBeAg的表達(dá)，并持續(xù)至10周均為陽性

8、。其中HBsAg的表達(dá)水平經(jīng)歷了一個(gè)上升-下降-再上升的過程(注射后第4周為最低)。而HBeAg表達(dá)水平則比較穩(wěn)定持續(xù)。10周后處死動(dòng)物，取血和肝組織進(jìn)行檢測(cè)。肝臟組織切片HE染色進(jìn)行病理分析，未見明顯的炎細(xì)胞浸潤及組織結(jié)構(gòu)異常；免疫組化分析顯示3只小鼠肝臟中HBsAg和HBeAg均為陽性。提取肝組織基因組DNA，用PCR方法檢測(cè)HBV S基因，結(jié)果3只小鼠均為陽性；進(jìn)一步用熒光定量PCR法試劑盒(深圳匹基公司)檢測(cè)血清和肝臟組織中的H

9、BV DNA，3只小鼠血清中的HBV DNA拷貝數(shù)分別為4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL；肝臟中分別為8.0×106、5.7×106、2.6×106 copies/g肝組織。為了進(jìn)一步了解所導(dǎo)入的HBV DNA在肝臟內(nèi)的復(fù)制是按AAV病毒復(fù)制方式還是按HBV病毒方式進(jìn)行的，我們?cè)?.3拷貝的HBV非重復(fù)區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性PCR引物，對(duì)肝臟組織基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果提示，肝臟中的確存在HBV病毒的復(fù)制方

10、式。之后，我們初步比較了2種不同品系的小鼠(C57BL/6與Balb/c)注射rAAV8-HBV1.3制備HBV動(dòng)物模型的效果。結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠能持續(xù)表達(dá)HBsAg和HBeAg24周以上，而Balb/c小鼠則表現(xiàn)為持續(xù)表達(dá)HBeAg，但HBsAg僅在前2周陽性，之后轉(zhuǎn)為陰性，同時(shí)HBsAb出現(xiàn)陽性。這些結(jié)果提示，C57BL/6小鼠比較容易形成對(duì)HBV病毒基因表達(dá)的耐受；而Balb/c可能更適合制備慢性乙型肝炎模型。本研究為下