KRP203對大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能影響研究.pdf

1、目的：探討鞘氨醇-1-磷酸-1（S1P1）受體激動劑KRP203對大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞增殖、分化及遷移功能的影響。
　　方法:增殖部分：磁珠分選SD大鼠脾臟來源的CD4+T淋巴細(xì)胞，抗CD3單克隆抗體刺激活化48小時后加入不同濃度的KRP203處理，根據(jù)培養(yǎng)基中KRP203濃度的不同，實驗分為四組：Control組，10ng/ml組，100ng/ml組，1000ng/ml組。T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)5天后，CCK8檢測其增殖情況；分化部分

2、：培養(yǎng)2天組：刺激活化方法同上，向活化狀態(tài)細(xì)胞每24小時加不同濃度KRP203培養(yǎng)，培養(yǎng)2天，流式細(xì)胞儀檢測不同實驗組 CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例變化。培養(yǎng)5天組：同樣方法細(xì)胞培養(yǎng)5天，流式細(xì)胞儀檢測不同實驗組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例變化。QPCR檢測CD4+T細(xì)胞S1P1mRNA和FoxP3 mRNA表達(dá)情況，QPCR法檢測Th1、Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA和Gata-3 mRNA表達(dá)情況，QPCR法檢測

3、各組Th1、Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達(dá)情況，ELISA試劑盒檢測上述細(xì)胞上清液IL-2、IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子濃度；遷移部分：將抗CD3單克隆抗體刺激活化的CD4+T淋巴細(xì)胞放置直徑為3μm的上層遷移小室，下層24孔培養(yǎng)板孔予不同濃度的KRP203（0ng/ml、10 ng/ml、100ng/ml、1000 ng/ml）和100ng/mlSDF-1處理，置于5％CO2、37℃培養(yǎng)

4、箱內(nèi)培養(yǎng)4h，計數(shù)統(tǒng)計不同實驗組CD4+T淋巴細(xì)胞遷移數(shù)量。
　　結(jié)果：在增殖結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)：10 ng/ml、100ng/ml、1000 ng/ml的KRP203與CD4+T細(xì)胞處理培養(yǎng)后，各實驗處理組與Control組細(xì)胞增殖無明顯差異；在培養(yǎng)2天組的分化結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)：10 ng/ml、100ng/ml、1000 ng/ml的KRP203藥物處理組與空白對照組相比 CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例無明顯變化，各藥物處理組，

5、組間無統(tǒng)計學(xué)差異。在培養(yǎng)5天組的分化結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)：1000ng/ml組與 Control組相比Treg細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余各組間相比無統(tǒng)計學(xué)差異。在各藥物處理5天藥物處理組中S1P1mRNA和FoxP3mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異。1000ng/ml組T-bet mRNA表達(dá)較Control組表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他藥物處理組與Control組對比無明顯差異，各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異

6、。Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-2mRNA100ng/ml組和1000ng/ml組表達(dá)較Control組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。100ng/ml組和1000ng/ml組 Gata-3 mRNA表達(dá)較Control組表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-4和IL-5mRNA表達(dá)在100ng/ml組和1000ng/ml組較Control組增多差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），100ng/ml組

7、和1000ng/ml組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL-10mRNA表達(dá)各處理組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA檢測結(jié)果：Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ濃度1000ng/ml組較Control組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4100ng/ml組和1000ng/ml組較Control組濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在遷移結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)：100ng/ml組和1000n