矽肺大鼠噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建與矽肺相關(guān)抗體篩選.pdf

1、目的:
　　大量研究表明矽肺病的發(fā)生發(fā)展過程與機體免疫功能的變化密切相關(guān)，包括非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫等均發(fā)揮了重要作用。矽塵是一種半抗原，可有選擇地吸附體內(nèi)物質(zhì)組成復(fù)合抗原，巨噬細胞損傷或凋亡釋放的脂蛋白等可成為自身抗原，因此塵肺的肺組織具有復(fù)雜的抗原成分。國內(nèi)外學(xué)者均觀察到矽肺病患者機體體液免疫功能明顯增強，而矽肺患者細胞免疫功能大多降低。以往研究表明，接塵工人、矽肺患者體內(nèi)存在病理情況下才出現(xiàn)的的抗體即自身抗體，但由

2、于技術(shù)限制，僅對某一或某些抗體進行了檢測，對某些期別、某個階段的抗體進行了探討，尚缺乏對矽肺病免疫抗體改變的全譜、全程、系統(tǒng)的觀察研究。
　　隨著近年來細胞免疫學(xué)、分子免疫學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，抗體庫技術(shù)越來越成熟，為探討矽肺免疫抗體在塵肺的發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的途徑和方法。噬菌體展示技術(shù)是以噬菌體外殼蛋白 PⅢ或 PⅧ基因為載體，在噬菌體中插入一段需要表達的基因片段，該外源基因片段可以在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空

3、間構(gòu)象表達相應(yīng)的蛋白。利用隨機短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白 PⅢ融合，并展示在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機肽庫以來，噬菌體展示技術(shù)運用已經(jīng)相當(dāng)成熟，關(guān)于人源塵肺病噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建，篩選出了幾種煤工塵肺相關(guān)抗原抗體，并驗證了其在接塵工人和煤工塵肺病患者血液中的表達，考慮到煤工塵肺患者接觸的為混合性粉塵，且人群免疫反應(yīng)較為復(fù)雜，影響因素較多，采用單一性二氧化硅粉塵構(gòu)建大鼠矽肺模型，建立相對較為特異的矽肺噬菌體單鏈

4、抗體庫并從中篩選出矽肺相關(guān)抗體具有重要意義。
　　方法:
　　1.構(gòu)建大鼠矽肺模型：對大鼠進行二氧化硅懸液肺灌注，采用非氣管暴露法經(jīng)口間斷注入二氧化硅懸液1ml（含SiO2100mg），注意觀察其活動狀態(tài)，灌注完成后輕撫大鼠胸部使粉塵分散至全肺，并使大鼠盡快解除窒息，以相同方法灌注1ml生理鹽水作為對照組。分別在3、6、9、12周每個時間點實驗組和對照組各處死6只，取組織樣本和外周血備用。
　　2.擴增單鏈抗體基因：提

5、取矽肺模型構(gòu)建成功的大鼠外周血，用大鼠外周血淋巴細胞分離液提取淋巴細胞，Triozl法提取單核細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用兼并引物經(jīng)PCR擴增抗體輕重鏈可變區(qū)基因，使用帶有粘端的Linker將輕重鏈可變區(qū)連接成單鏈抗體。
　　3.構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫：將單鏈抗體和噬菌粒載體 PCANTAB-5e進行雙酶切后進行拼接，然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體超感染，最終構(gòu)建成大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫。

6、>　　4.對大鼠矽肺噬菌體單鏈抗體庫富集篩選：提取模型大鼠肺組織蛋白和對照組肺組織蛋白，對已構(gòu)建好的噬菌體單鏈抗體庫進行4輪富集篩選，測定其庫容量。
　　5.矽肺噬菌體單鏈抗體特異性檢測：隨機選取最后一輪篩選后抗性平板上菌落20個，提取質(zhì)粒包被在酶標(biāo)板中，ELISA檢測矽肺大鼠(P)和對照組(N)肺組織蛋白OD450值，以P/N>2.0為陽性克隆。
　　6.對陽性克隆鑒定：將陽性克隆質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進行

7、 BLAST比對，然后將測序結(jié)果翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列并對翻譯結(jié)果進行分析。
　　結(jié)果:
　　1.利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了庫容量為7.2×109cfu/L的初級噬菌體單鏈抗體庫。
　　2.以提取的矽肺模型肺組織蛋白為靶蛋白，利用噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)4輪富集篩選，成功篩選出具有較高親和力的抗矽肺大鼠的噬菌體單鏈抗體庫，通過ELISA方法，并經(jīng)核酸測序及BLAST比對，從中篩選出3個大鼠矽肺模型相關(guān)抗體，分別是抗IFN-