基于慈竹轉(zhuǎn)錄組克隆WRKY基因及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的轉(zhuǎn)錄家族，參與植物生長發(fā)育、衰老、生物脅迫、非生物脅迫以及次生代謝的過程。本研究以慈竹筍 RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他植物已知 WRKY序列信息，設(shè)計(jì)特異引物，克隆到兩條 WRKY序列，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、脅迫誘導(dǎo)表達(dá)以及遺傳轉(zhuǎn)化，為通過基因手段改良慈竹品種奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.在慈竹筍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，從慈竹中克隆了兩條 WRKY，分別命名 BeWRKY1和 BeWRK

2、Y2， GenBank注冊號為 KJ462124和KJ462125。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，BeWRKY1和 BeWRKY2基因全長序列分別為570bp和888bp，分別編碼189個和295個氨基酸殘基。BeWRKY1編碼的蛋白呈酸性，而 BeWRKY2編碼的蛋白呈堿性。兩者編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)含有豐富的無規(guī)則卷曲，較多的α-螺旋、延伸鏈，較少的β-轉(zhuǎn)角。預(yù)測 BeWRKY1編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)含有8個β-折疊，7個β-轉(zhuǎn)角

3、；預(yù)測 BeWRKY2編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)含有6個β-折疊，9個β-轉(zhuǎn)角，兩者結(jié)構(gòu)存在一定的差別。兩個基因編碼的蛋白均含有 WRKY superfamily保守結(jié)構(gòu)域。 BeWRKY1和PheWRKY1親緣關(guān)系最近， BeWRKY2和 TaWRKY16親緣關(guān)系最近。兩者編碼的蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核，蛋白既沒有跨膜運(yùn)動也沒有肽信號區(qū)域。
　　3.BeWRKY1和 BeWRKY2基因的組織表達(dá)模式分析結(jié)果顯示:BeWRKY1相對表達(dá)量

4、依次為莖>筍>未展開葉>完全展開葉，莖中的相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它部位。而 BeWRKY2的相對表達(dá)量為完全展開葉>莖>未展開葉>筍，展開葉的相對表達(dá)量最豐富。
　　4.對慈竹幼苗進(jìn)行 ABA(200μmol/L)、NaCl(200 mmol/L)、PEG-6000(20％)脅迫處理，通過 Real-time PCR技術(shù)對 BeWRKY1和BeWRKY2基因進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)差異性表達(dá)分析。結(jié)果表明，200μmol/L NaCl和20%

5、PEG-6000脅迫處理激活了 BeWRKY1表達(dá)，卻減少了BeWRKY2的轉(zhuǎn)錄積累；BeWRKY1可能短時間內(nèi)迅速參與逆境響應(yīng)， BeWRKY2對干旱和 ABA脅迫傷害更為敏感，而可能不參與高鹽類脅迫保護(hù)反應(yīng)。
　　5.構(gòu)建了 BeWRKY1和 BeWRKY2的植物過表達(dá)載體和 RNAi表達(dá)載體，分別為 pCAMBIA-BeWRKY1、 pCAMBIA-BeWRKY2、pCAMBIA–BeWRKY1-RNAi和 pCAMBIA–