魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建分析及免疫相關(guān)基因的克隆、表達(dá)、抗菌活性研究.pdf

1、魁蚶（Scapharca broughtonii）屬于軟體動(dòng)物門（Mollusc），雙殼綱（Bivalve），蚶目（Arcoida），蚶科（Arcoidae），毛蚶屬（Arca））。殼面有42-48條放射肋，以43條者居多。主要分布于我國渤海及黃海北部?？酪蚱鋫€(gè)體大、生長快，肉味鮮美，富含蛋白質(zhì)和多種維生素，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國出口換匯率較高的水產(chǎn)品之一。近幾年來，我們課題組對魁蚶的血細(xì)胞形態(tài)、免疫功能及種質(zhì)資源和遺傳多樣性做過

2、研究，發(fā)現(xiàn)魁蚶對鰻弧菌具有較強(qiáng)的抗菌功能。早期野生魁蚶資源豐富，市面上銷售的也都是野生捕撈種。近年來，近海養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和人類活動(dòng)的日漸頻繁，導(dǎo)致灘涂生態(tài)環(huán)境惡化，加之過度捕撈，野生魁蚶群體出現(xiàn)病害和資源量下降的現(xiàn)象。為恢復(fù)其資源，魁蚶增殖放流和人工養(yǎng)殖便應(yīng)運(yùn)而生，且發(fā)展迅猛，為防止魁蚶在規(guī)?；B(yǎng)殖過程中爆發(fā)病害，需加強(qiáng)魁蚶抗病選育及其免疫機(jī)制研究。然而相關(guān)研究報(bào)道還較少，主要是運(yùn)用傳統(tǒng)分析學(xué)方法在細(xì)胞水平上對血細(xì)胞及其免疫功能等進(jìn)

3、行一些基礎(chǔ)性的研究，有關(guān)魁蚶免疫系統(tǒng)作用的分子機(jī)制研究在國內(nèi)外幾乎還是空白?？拦δ芑虻难芯靠蔀榧膊》乐翁峁├碚摶A(chǔ)，因此發(fā)掘魁蚶免疫基因、加強(qiáng)免疫機(jī)制研究顯得尤為重要，深入挖掘魁蚶免疫因子對其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究通過Illumia HiseqTM2000技術(shù)構(gòu)建并分析魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫。采用拼接軟件Trinity對所得序列進(jìn)行de-novo組裝，共獲得86,689條高質(zhì)量unigenes（>200 bp

4、），總長度為71,873,603bp，平均長度829bp，N50長度為2256bp，N90長度是454bp，最長的序列為33,269bp。通過BLAST比對進(jìn)行基因功能注釋：共有22,117（25.51％）條unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫中存在相似序列，分別有21,404（24.69%）、21,207（24.46%）條unigenes在GO和PFAM數(shù)據(jù)庫中注釋成功，在注釋成功的序列中有7,531條序列被定位在31個(gè)KEGG的通路當(dāng)中。結(jié)

5、果表明：構(gòu)建的魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量較高，篩選獲得的免疫相關(guān)unigenes為魁蚶功能基因的分子克隆和研究奠定基礎(chǔ)。
　　采用RACE技術(shù)克隆獲得魁蚶錳超氧化物歧化酶（MnSOD）基因全長cDNA序列，命名為SbMnSOD。序列結(jié)構(gòu)分析表明：SbMnSOD基因cDNA全長1003 bp，5’-和3’-非編碼區(qū)（UTR）分別為32bp、275bp；開放閱讀框長696bp，編碼一個(gè)由232個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測的蛋白分子量為25.67K

6、Da，理論等電點(diǎn)為7.13。；4個(gè)負(fù)責(zé)與金屬離子Mn2+結(jié)合的保守氨基酸殘基分別為His57，His105，Asp190，His194；MnSOD的特征序列為-DVWEHAYY-。同源性分析結(jié)果表明，SbMnSOD氨基酸序列與其他軟體動(dòng)物MnSOD氨基酸序列的相似性達(dá)66%-91%，與蟹類的相似度高于蝦類。qRT-PCR結(jié)果顯示：SbMnSOD基因在魁蚶斧足、腮、外套膜、肝胰腺、閉殼肌和血細(xì)胞中都有表達(dá)，血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量最高；注射鰻

7、弧菌Vibrio anguillarum后，各組織中SbMnSOD基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，且表達(dá)量均表現(xiàn)出不同程度的滯后性。重組蛋白可以有效地抑制大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和藤黃微球菌（Micrococcus leteus）的生長；且重組蛋白耐高溫、耐酸堿。
　　采用RACE技術(shù)克隆獲得魁蚶鐵蛋白（ferritin）基因全長cDNA序列，命名為SbFer。序列結(jié)構(gòu)分析表明：

8、cDNA全長930bp，5’-和3’-UTR分別為182bp和229bp；開放閱讀框長519bp，編碼一個(gè)由172個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測分子量為20.0kDa，理論等電點(diǎn)5.16。PCR擴(kuò)增獲得魁蚶鐵蛋白基因的內(nèi)含子，間插在4個(gè)外顯子之間。5’-UTR存在高度保守的鐵反應(yīng)元件。SbFer氨基酸序列具有脊椎動(dòng)物鐵蛋白基因的諸多功能序列。同源性分析表明，SbFer氨基酸序列與其他軟體動(dòng)物的相似性為63%-96%，與脊椎動(dòng)物H型鐵蛋白的相似

9、性高于L型鐵蛋白；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，SbFer與無脊椎動(dòng)物鐵蛋白先聚為一支，再與脊椎動(dòng)物H型鐵蛋白聚類。qRT-PCR結(jié)果指出，SbFer基因在各組織中均有表達(dá)，在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量最高；感染鰻弧菌后，SbFer基因在各組織中的表達(dá)量在除斧足外的其他組織中均顯著上調(diào)，且具有一定的時(shí)間依賴性。重組蛋白的抑菌試驗(yàn)結(jié)果指出其可以有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的生長。
　　采用RACE技術(shù)獲得魁蚶熱休克蛋白90（HSP90

10、）基因cDNA全長序列，命名為SbHSP90。序列和結(jié)構(gòu)分析表明：cDNA全長2707bp，5’-和3’-UTR長分別為195bp，325bp，開放閱讀框長2187bp，編碼一個(gè)由728個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測分子量為83.72kDa，理論等電點(diǎn)為4.85。SbHSP90氨基酸序列含有HSP90家族共有的5個(gè)簽名序列，ATP酶結(jié)構(gòu)域和C末端高度保守的MEEVD短肽序列。同源性及系統(tǒng)分析表明，SbHSP90氨基酸序列與軟體動(dòng)物的HSP90

11、氨基酸序列的相似性達(dá)到83%以上，與脊椎動(dòng)物HSP90-α和HSP90-β的同源性很接近。qRT-PCR結(jié)果表明：SbHSP90基因在魁蚶6種組織中均有表達(dá)，斧足中的表達(dá)量最高，而在肝胰腺中的表達(dá)量最低；注射鰻弧菌后，SbHSP90基因在不同組織中的表達(dá)量都顯著上調(diào)，且具有顯著的時(shí)間依賴性和瞬時(shí)表達(dá)趨勢。
　　采用RACE技術(shù)克隆獲得魁蚶半乳糖凝集素（Galectin）基因cDNA全長，命名為SbGal。序列和結(jié)構(gòu)分析表明：該cD

12、NA全長3120bp，5’-和3’-UTR長分別為213bp、1342bp，開放閱讀框長1565bp，編碼554個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白的分子量為63.32kDa，理論等電點(diǎn)為4.99。SbGal是一個(gè)含有4個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域的在雙殼貝類中較為獨(dú)特的半乳糖凝集素。同源性及系統(tǒng)分析表明：SbGal氨基酸序列與其他軟體動(dòng)物半乳糖凝集素氨基酸序列的同源性為46%-70%，其四個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域彼此的相似性為36%-41%。qRT-PC結(jié)果表明：SbGal基