Epb41l3在食管鱗癌中發(fā)揮抑癌作用并影響預后的功能及其機制研究.pdf

1、食管鱗癌的發(fā)生是由諸多步驟逐漸促發(fā)的多級過程。其中就包括了原癌基因的激活以及抑癌基因的失活。抑癌基因是指一大類可抑制細胞生長，并且具有潛在抑制癌變作用的基因。
　　DNA的甲基化的本質是一種簡單的共價化學修飾，它是以S-腺苷蛋氨酸作為甲基供體，由DNA甲基化轉移酶催化，將胞嘧啶轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應。EPB41L3又名4.1B、Dal-1，是一種屬于4.1家族的重要膜骨架蛋白，在人類多種組織器官中廣泛表達。與此相對的是，越來越

2、多的研究發(fā)現EPB41L3在多種腫瘤中呈現異常表達。
　　目的:
　　本課題旨在探究EPB41L3在食管鱗癌中發(fā)生甲基化和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及其機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)與處理
　　Het1a、TE1、KYSE150、KYSE450、KYSE510細胞使用RPMI-1640，Eca109、Caes17細胞使用高糖DMEM，均分別添加10％胎牛血清，將細胞培養(yǎng)箱的溫度設置為37℃、CO2為5％的

3、濃度，相對濕度為50％，之后根據細胞的生長速度更換培養(yǎng)基，一般為1-2天，用含有0.25％胰蛋白酶以及0.02％EDTA的胰酶工作液消化并使細胞分散，進行傳代或接種培養(yǎng)。
　　2.侵襲試驗
　　將細胞培養(yǎng)至良好狀態(tài)，傳代至24或12孔培養(yǎng)板，按常規(guī)細胞培養(yǎng)流程過夜培養(yǎng)，待細胞生長到處于對數生長期，細胞融合密度達80％左右時，采用invitrogen公司的轉染試劑Lipofectamine2000進行轉染，具體操作參考說明書，

4、轉染達到48小時后，分別進行提取細胞的總蛋白以及遷移和侵襲的檢測。遷移試驗時，用無血清培養(yǎng)基將1.0×105細胞重懸接種于BD小室內;侵襲試驗時用無血清培養(yǎng)基將2.0×105細胞重懸接種于Matrigel包被的BD小室內。37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后取出小室，用PBS輕輕漂洗，用95％甲醇室溫固定20min;甲醛配制的0.25％結晶紫予以染色，室溫染色30min，清水漂凈，用棉簽擦去上室內細胞;鏡下拍照計數。
　　3.劃痕實驗

5、r>　　4.免疫印跡試驗
　　5.普通PCR
　　采用Omega公司Omega Total RNA Kit I(Omega, GA，USA)提取食管鱗癌細胞總RNA;分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度，并進行質量控制檢測;采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser進行逆轉錄;將逆轉錄完的cDNA與其他試劑混合，配置PCR反應液，并放入熱循環(huán)儀，按相應PCR

6、反應條件進行加熱;最后將加熱產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
　　6.熒光定量PCR
　　應用Omega公司Omega Total RNA Kit I(Omega，GA，USA)提取食管鱗癌細胞總RNA;采用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度，從而得以進行質量控制檢測;采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser(Takara Bio Inc，Japan)進行逆轉錄

7、，之后用SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio Inc，Japan)進行實時定量，GAPDH作為本實驗的內參。具體實驗流程參照相關各試劑盒說明。
　　7.CCK8
　　使用日本同仁公司的CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況，具體實驗流程參照試劑盒說明。
　　8.流式細胞學檢測周期與凋亡
　　使用中國凱基公司的試劑盒分別檢測細胞周期與凋亡狀態(tài)。具體實驗流程參照試劑盒說明。
　　9.免疫組化

8、>　　常規(guī)脫蠟水合;加熱;冷卻至室溫;3％H2O2室溫處理10min;山羊血清室溫封閉;一抗4℃過夜;二抗室溫孵育;DAB顯色;蘇木素復染;1％鹽酸酒精分化;水洗反藍;晾干封片。
　　10.甲基化修飾與甲基化PCR
　　使用美國Omega公司的Tissue DNA Kit提取七種細胞DNA，分光光度計DNA的濃度，應用Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification Kit進行甲基化修飾，采用中

9、國Takara公司的TaKaRa Taq Hot Start Version配液并處理，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測EPB41 L3在各細胞中的甲基化狀態(tài)。具體實驗流程參照相應試劑盒說明。
　　11.焦磷酸測序
　　12.明膠酶譜
　　使用中國萊德爾公司的試劑盒MMP Zymography Assay Kit檢測細胞中mmp2與mmp9的活性。具體實驗流程參照相應試劑盒說明。
　　13.裸鼠成瘤
　　14.統(tǒng)計學

10、處理
　　兩組之間的差異比較使用獨立樣本t檢驗(Independent-samples t test)，三組以上比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。EPB41L3之間的關系和食管鱗狀細胞癌的臨床病理特征應用x2檢驗。生存曲線使用Kaplan Meier方法和log-rank進行分析。單變量和多變量分析使用Cox比例風險回歸模型。統(tǒng)計學意義設定在p＜0.05時。所有實驗重復至少三次。所有數據被用平均值±標準差(me

11、an±SD)表示。使用SPSS13.0版軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1.EPB41L3在食管鱗癌組織和細胞中低表達，且在食管鱗癌細胞中發(fā)揮抑癌作用
　　(1)EPB41L3在食管鱗癌組織和細胞中的表達低于食管癌旁組織與食管上皮細胞，并與腫瘤浸潤深度、TNM分期以及生存期呈相關。
　　為了檢測EPB41L3在食管癌中的表達，我們先在組織層面上予以檢測:采用97例石蠟包埋的食管鱗癌及癌旁正常食管上皮組織的組織

12、芯片進行免疫組化，發(fā)現在91例食管鱗癌旁組織的細胞膜和細胞質中，EPB41L3呈高表達，6例為低表達或不表達;而在72例食管癌組織中，EPB41L3為低表達或不表達，20例為高表達。接著在細胞層面上予以檢測:我們發(fā)現在六株食管鱗癌細胞中，EPB41L3的表達均低于正常食管上皮細胞。接著我們對組織芯片的病理及生存期資料進行分析，發(fā)現 EPB41L3的表達水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤病理類型或淋巴結是否陽性無關，而與腫瘤浸潤深度和T

13、NM分期呈相關(P=0.016)。而且，與患者的生存期也是正相關(P=0.002）。
　　(2)EPB41L3在食管鱗癌細胞中發(fā)揮抑癌功能
　　我們的實驗從增殖、凋亡、遷移侵襲和細胞周期四個方面闡述EPB41L3對食管鱗癌的抑癌功能。首先我們通過轉染使得EPB41L3在食管鱗癌細胞KYSE150，KYSE510和KYSE450過表達后，進行CCK8和克隆形成實驗，結果證實轉染后的食管鱗癌細胞增長與克隆形成能力明顯受到抑制。之

14、后的體外實驗中，通過小鼠皮下荷瘤，支持了之前體內增殖實驗的結果。接著我們又用流式細胞學檢測的方法進行凋亡相關研究。結果發(fā)現EEPB41L3過表達組的凋亡率明顯高于對照組。為了檢測細胞遷移侵襲功能，我們進行了劃痕與Transwell實驗。證實了EPB41L3可抑制食管鱗癌細胞的遷移與侵襲。最后，我們還用流式細胞學檢測的方法，發(fā)現EPB41L3可引起G2/M阻滯。
　　2.EPB41L3在食管鱗癌組織和細胞中低表達并發(fā)揮抑癌功能的機制

15、
　　(1)EPB41L3在食管鱗癌細胞中發(fā)生甲基化而表達下調
　　對于正常食管上皮細胞Het-1a和六株食管鱗癌細胞，我們進行甲基化PCR，這是是否發(fā)生甲基化的定性實驗，結果EPB41L3在正常食管細胞Het-1a中未發(fā)生甲基化，而在食管鱗癌細胞中均發(fā)生了部分甲基化。接著我們進行焦磷酸測序這一定量研究。檢測CpG島上位于-141551，-141494，-141439，-141379 bp處的33個位點的甲基化狀態(tài)，結果EP

16、B41L3在六株食管鱗癌細胞系中的五株里顯示為高甲基化，而在食管正常細胞中為非甲基化。而之后用去甲基化藥物5-Aza-2-deoxygcitidine處理食管鱗癌細胞再行PCR, RT-PCR和免疫印跡來檢測EPB41L3的表達情況時，結果顯示EPB41L3在食管鱗癌恢復表達。上述實驗綜合說明了EPB41 L3的確在食管鱗癌中發(fā)生甲基化。
　　(2)Epb41l3通過PI3K/MAPK，Caspase3/8/9和Cdc2/Cycl

17、in B1通路調節(jié)發(fā)揮抑癌作用。
　　結論:
　　本研究中，我們首次揭示了EPB41L3在食管鱗癌中發(fā)生甲基化并起到抑癌作用及其機制。我們發(fā)現在食管鱗癌組織中EPB41L3表達降低，且在食管鱗癌中的表達量低于臨近正常組織。在食管鱗癌細胞中，EPB41L3因發(fā)生甲基化而表達下調，進而抑制食管鱗癌細胞的增殖和侵襲，誘導凋亡和G2/M阻滯的發(fā)生。進一步的機制分析還證明了MAPK，Caspase3/8/9，Cdc2/CyclinB1