Epb41l3在食管鱗癌中發(fā)揮抑癌作用并影響預(yù)后的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、食管鱗癌的發(fā)生是由諸多步驟逐漸促發(fā)的多級(jí)過程。其中就包括了原癌基因的激活以及抑癌基因的失活。抑癌基因是指一大類可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并且具有潛在抑制癌變作用的基因。
　　DNA的甲基化的本質(zhì)是一種簡(jiǎn)單的共價(jià)化學(xué)修飾，它是以S-腺苷蛋氨酸作為甲基供體，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶催化，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應(yīng)。EPB41L3又名4.1B、Dal-1，是一種屬于4.1家族的重要膜骨架蛋白，在人類多種組織器官中廣泛表達(dá)。與此相對(duì)的是，越來越

2、多的研究發(fā)現(xiàn)EPB41L3在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)。
　　目的:
　　本課題旨在探究EPB41L3在食管鱗癌中發(fā)生甲基化和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　Het1a、TE1、KYSE150、KYSE450、KYSE510細(xì)胞使用RPMI-1640，Eca109、Caes17細(xì)胞使用高糖DMEM，均分別添加10％胎牛血清，將細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為37℃、CO2為5％的

3、濃度，相對(duì)濕度為50％，之后根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度更換培養(yǎng)基，一般為1-2天，用含有0.25％胰蛋白酶以及0.02％EDTA的胰酶工作液消化并使細(xì)胞分散，進(jìn)行傳代或接種培養(yǎng)。
　　2.侵襲試驗(yàn)
　　將細(xì)胞培養(yǎng)至良好狀態(tài)，傳代至24或12孔培養(yǎng)板，按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)流程過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞融合密度達(dá)80％左右時(shí)，采用invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作參考說明書，

4、轉(zhuǎn)染達(dá)到48小時(shí)后，分別進(jìn)行提取細(xì)胞的總蛋白以及遷移和侵襲的檢測(cè)。遷移試驗(yàn)時(shí)，用無血清培養(yǎng)基將1.0×105細(xì)胞重懸接種于BD小室內(nèi);侵襲試驗(yàn)時(shí)用無血清培養(yǎng)基將2.0×105細(xì)胞重懸接種于Matrigel包被的BD小室內(nèi)。37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后取出小室，用PBS輕輕漂洗，用95％甲醇室溫固定20min;甲醛配制的0.25％結(jié)晶紫予以染色，室溫染色30min，清水漂凈，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞;鏡下拍照計(jì)數(shù)。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)

5、r>　　4.免疫印跡試驗(yàn)
　　5.普通PCR
　　采用Omega公司Omega Total RNA Kit I(Omega, GA，USA)提取食管鱗癌細(xì)胞總RNA;分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度，并進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè);采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;將逆轉(zhuǎn)錄完的cDNA與其他試劑混合，配置PCR反應(yīng)液，并放入熱循環(huán)儀，按相應(yīng)PCR

6、反應(yīng)條件進(jìn)行加熱;最后將加熱產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
　　6.熒光定量PCR
　　應(yīng)用Omega公司Omega Total RNA Kit I(Omega，GA，USA)提取食管鱗癌細(xì)胞總RNA;采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度，從而得以進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè);采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser(Takara Bio Inc，Japan)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄

7、，之后用SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio Inc，Japan)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，GAPDH作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參。具體實(shí)驗(yàn)流程參照相關(guān)各試劑盒說明。
　　7.CCK8
　　使用日本同仁公司的CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，具體實(shí)驗(yàn)流程參照試劑盒說明。
　　8.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)周期與凋亡
　　使用中國凱基公司的試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡狀態(tài)。具體實(shí)驗(yàn)流程參照試劑盒說明。
　　9.免疫組化

8、>　　常規(guī)脫蠟水合;加熱;冷卻至室溫;3％H2O2室溫處理10min;山羊血清室溫封閉;一抗4℃過夜;二抗室溫孵育;DAB顯色;蘇木素復(fù)染;1％鹽酸酒精分化;水洗反藍(lán);晾干封片。
　　10.甲基化修飾與甲基化PCR
　　使用美國Omega公司的Tissue DNA Kit提取七種細(xì)胞DNA，分光光度計(jì)DNA的濃度，應(yīng)用Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification Kit進(jìn)行甲基化修飾，采用中

9、國Takara公司的TaKaRa Taq Hot Start Version配液并處理，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)EPB41 L3在各細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)。具體實(shí)驗(yàn)流程參照相應(yīng)試劑盒說明。
　　11.焦磷酸測(cè)序
　　12.明膠酶譜
　　使用中國萊德爾公司的試劑盒MMP Zymography Assay Kit檢測(cè)細(xì)胞中mmp2與mmp9的活性。具體實(shí)驗(yàn)流程參照相應(yīng)試劑盒說明。
　　13.裸鼠成瘤
　　14.統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、處理
　　兩組之間的差異比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samples t test)，三組以上比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。EPB41L3之間的關(guān)系和食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理特征應(yīng)用x2檢驗(yàn)。生存曲線使用Kaplan Meier方法和log-rank進(jìn)行分析。單變量和多變量分析使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義設(shè)定在p＜0.05時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。所有數(shù)據(jù)被用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(me

11、an±SD)表示。使用SPSS13.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.EPB41L3在食管鱗癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用
　　(1)EPB41L3在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)低于食管癌旁組織與食管上皮細(xì)胞，并與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期以及生存期呈相關(guān)。
　　為了檢測(cè)EPB41L3在食管癌中的表達(dá)，我們先在組織層面上予以檢測(cè):采用97例石蠟包埋的食管鱗癌及癌旁正常食管上皮組織的組織

12、芯片進(jìn)行免疫組化，發(fā)現(xiàn)在91例食管鱗癌旁組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，EPB41L3呈高表達(dá)，6例為低表達(dá)或不表達(dá);而在72例食管癌組織中，EPB41L3為低表達(dá)或不表達(dá)，20例為高表達(dá)。接著在細(xì)胞層面上予以檢測(cè):我們發(fā)現(xiàn)在六株食管鱗癌細(xì)胞中，EPB41L3的表達(dá)均低于正常食管上皮細(xì)胞。接著我們對(duì)組織芯片的病理及生存期資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) EPB41L3的表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤病理類型或淋巴結(jié)是否陽性無關(guān)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度和T

13、NM分期呈相關(guān)(P=0.016)。而且，與患者的生存期也是正相關(guān)(P=0.002）。
　　(2)EPB41L3在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能
　　我們的實(shí)驗(yàn)從增殖、凋亡、遷移侵襲和細(xì)胞周期四個(gè)方面闡述EPB41L3對(duì)食管鱗癌的抑癌功能。首先我們通過轉(zhuǎn)染使得EPB41L3在食管鱗癌細(xì)胞KYSE150，KYSE510和KYSE450過表達(dá)后，進(jìn)行CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌細(xì)胞增長(zhǎng)與克隆形成能力明顯受到抑制。之

14、后的體外實(shí)驗(yàn)中，通過小鼠皮下荷瘤，支持了之前體內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。接著我們又用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的方法進(jìn)行凋亡相關(guān)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EEPB41L3過表達(dá)組的凋亡率明顯高于對(duì)照組。為了檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲功能，我們進(jìn)行了劃痕與Transwell實(shí)驗(yàn)。證實(shí)了EPB41L3可抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移與侵襲。最后，我們還用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的方法，發(fā)現(xiàn)EPB41L3可引起G2/M阻滯。
　　2.EPB41L3在食管鱗癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌功能的機(jī)制

15、
　　(1)EPB41L3在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)生甲基化而表達(dá)下調(diào)
　　對(duì)于正常食管上皮細(xì)胞Het-1a和六株食管鱗癌細(xì)胞，我們進(jìn)行甲基化PCR，這是是否發(fā)生甲基化的定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果EPB41L3在正常食管細(xì)胞Het-1a中未發(fā)生甲基化，而在食管鱗癌細(xì)胞中均發(fā)生了部分甲基化。接著我們進(jìn)行焦磷酸測(cè)序這一定量研究。檢測(cè)CpG島上位于-141551，-141494，-141439，-141379 bp處的33個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果EP

16、B41L3在六株食管鱗癌細(xì)胞系中的五株里顯示為高甲基化，而在食管正常細(xì)胞中為非甲基化。而之后用去甲基化藥物5-Aza-2-deoxygcitidine處理食管鱗癌細(xì)胞再行PCR, RT-PCR和免疫印跡來檢測(cè)EPB41L3的表達(dá)情況時(shí)，結(jié)果顯示EPB41L3在食管鱗癌恢復(fù)表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)綜合說明了EPB41 L3的確在食管鱗癌中發(fā)生甲基化。
　　(2)Epb41l3通過PI3K/MAPK，Caspase3/8/9和Cdc2/Cycl

17、in B1通路調(diào)節(jié)發(fā)揮抑癌作用。
　　結(jié)論:
　　本研究中，我們首次揭示了EPB41L3在食管鱗癌中發(fā)生甲基化并起到抑癌作用及其機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織中EPB41L3表達(dá)降低，且在食管鱗癌中的表達(dá)量低于臨近正常組織。在食管鱗癌細(xì)胞中，EPB41L3因發(fā)生甲基化而表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)凋亡和G2/M阻滯的發(fā)生。進(jìn)一步的機(jī)制分析還證明了MAPK，Caspase3/8/9，Cdc2/CyclinB1