Toll樣受體4表達(dá)調(diào)控在促紅細(xì)胞生成素抗炎與抑制大鼠心肌纖維化中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的:心血管疾病是全球范圍內(nèi)人類的第一死因。而心肌纖維化是多種心血管疾病（如心肌梗死、高血壓等）的病理基礎(chǔ)，它是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵病理特征和重要形成原因。已有研究證實(shí)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)能夠通過抑制心肌纖維化而起到保護(hù)心肌的作用，但是其具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究欲探討EPO拮抗心肌纖維化的具體機(jī)制，為心肌重構(gòu)和心肌纖維化的臨床防治提供新思路、新靶點(diǎn)和新方向，為EPO在心血管疾病中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

2、
　　方法:250-300g健康成年SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分成五組:對(duì)照組(Control)、腹主動(dòng)脈縮窄動(dòng)物模型組(AAC)、EPO過表達(dá)組(AAC+EPO)EPO和TLR4共過表達(dá)組(AAC+EPO+TLR4)和PI3K抑制劑組(AAC+EPO+LY294002)。AAC組大鼠行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù);AAC+EPO組大鼠行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)后通過心肌內(nèi)注射感染EPO慢病毒;AAC+EPO+TLR4組大鼠行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)后通過心肌

3、內(nèi)注射同時(shí)感染EPO和TLR4慢病毒;AAC+EPO+LY294002組行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)后通過心肌內(nèi)注射感染EPO慢病毒，并連續(xù)腹腔注射LY294002一個(gè)月;Control組不行腹主動(dòng)脈縮窄但行同樣切口并縫合，心肌內(nèi)注射等量生理鹽水;各組大鼠均在8周后處死取材。蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察大鼠心肌組織病理變化;qPCR用于檢測(cè)大鼠心肌組織中PI3K、Akt1和TLR4的mRNA水平;Western blotting用于

4、檢測(cè)大鼠心肌組織中PI3K、p-Akt、TLR4、TGF-β1、MMP-2和MMP-9等蛋白表達(dá)水平;免疫熒光用于觀察大鼠心肌組織中TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A等各項(xiàng)生化指標(biāo)變化。
　　結(jié)果:1、HE染色結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組心肌細(xì)胞直徑增大，心肌纖維束較寬大，肌纖維間疏松水腫，間隙

5、增寬，AAC+EPO組與AAC組相比心肌損傷較輕，AAC+EPO+TLR4組與AAC+EPO+LY294002組和AAC+EPO組相比，心肌損傷明顯加重。Masson染色結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂，膠原沉積嚴(yán)重，而AAC+EPO組心肌細(xì)胞相對(duì)于AAC組，心肌纖維排列較整齊，膠原沉積較輕;AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組與AAC+EPO組相比，心肌纖維排列明顯紊亂

6、，膠原沉積明顯加重。2、qPCR結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4 mRNA水平顯著上調(diào)，PI3K、Akt1的mRNA水平則顯著下降(P＜0.05);AAC+EPO組較AAC組TLR4的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，PI3K、Akt1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05);AAC+EPO+TLR4組較AAC+EPO組TLR4的mRNA表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05)，AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4 mRNA

7、表達(dá)量上調(diào)，PI3K、Akt1 mRNA水平則顯著下降(P＜0.05)。3、Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，PI3K、p-Akt表達(dá)水平則顯著下降(P＜0.05);AAC+EPO組較AAC組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，PI3K、p-Akt表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05);AAC+EPO+TLR

8、4組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05)，AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量上調(diào)，PI3K、p-Akt表達(dá)水平則顯著下降(P＜0.05)。4、免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05);AAC+EPO組較

9、AAC組TLR4、TGF-β1、TNF-α、 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.05)，AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組TLR4、TGF-β1、TNF-α、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)。5、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，AAC組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17A等濃度顯著增加(P＜0.05)，

10、AAC+EPO組較AAC組顯著降低(P＜0.05)，而AAC+EPO+TLR4組和AAC+EPO+LY294002組較AAC+EPO組顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、EPO能夠顯著抑制心肌纖維化，改善心肌重構(gòu)，與其能夠抑制炎癥因子的表達(dá)關(guān)系密切;2、EPO發(fā)揮抗心肌纖維化的作用可能是由TLR4介導(dǎo)參與的;3、EPO可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)TLR4的表達(dá)，進(jìn)而減少TGF-β1、IL-1β、IL-6、IL-1