無(wú)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白酶活性.pdf

1、蛋白酶，是水解蛋白質(zhì)或多肽的一類酶，在許多人體生理過(guò)程中具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在許多如炎癥、心血管疾病、癌癥等的病理?xiàng)l件下，蛋白酶活性也會(huì)發(fā)生改變。因此簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的蛋白酶檢測(cè)方法在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有重要意義。本文發(fā)展了無(wú)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光蛋白酶活性檢測(cè)新方法。本文由以下兩部分組成：
　　第一部分建立了基于鏈霉親和素修飾磁珠（MB-SAs）的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光（CL）法檢測(cè)蛋白酶活性。設(shè)計(jì)了一條生物素化的多肽（bio-P1）

2、，其包含精氨酸（Arg）和一個(gè)末端半光氨酸（Cys），作為胰蛋白酶的水解底物。將bio-P1加入到堿性魯米諾（luminol）-NaIO4溶液，bio-P1末端的Cys能夠催化溶液反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的CL信號(hào)。當(dāng)通過(guò)鏈霉親和素-生物素反應(yīng)將bio-P1固定在MB-SAs表面后，再加入到堿性 luminol-NaIO4溶液中，溶液僅發(fā)出微弱的CL信號(hào)。基于此，我們建立了基于CL信號(hào)恢復(fù)的CL法檢測(cè)蛋白酶活性及其抑制劑。該方法不需要洗滌或分離過(guò)程

3、，線性范圍為0.01nM-2nM，檢測(cè)限為10pM。通過(guò)檢測(cè)胰蛋白酶抑制劑，我們發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶抑制劑SBTI、PMSF和EDTA對(duì)胰蛋白酶抑制的IC50（抑制效率為50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的的抑制劑濃度）分別為1nM、0.01mM和3.28mM。另外，通過(guò)簡(jiǎn)單的改變多肽底物，此方法能夠拓寬至其他蛋白酶的檢測(cè)。
　　第二部分，我們?cè)O(shè)計(jì)了含有Arg和末端Cys的多肽（P），利用氧化石墨烯（GO）和luminol-NaIO4-P CL系統(tǒng)，發(fā)展了無(wú)

4、標(biāo)記的CL傳感器檢測(cè)胰蛋白酶活性及其抑制劑。該方法依據(jù)P和P-GO復(fù)合物對(duì)luminol-NaIO4 CL反應(yīng)的催化作用不同而建立。將P和luminol-NaIO4堿性溶液混合，檢測(cè)到很強(qiáng)的CL信號(hào)。然而，將P-GO復(fù)合物和luminol-NaIO4溶液混合，只能檢測(cè)到微弱的CL信號(hào)?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們建立了無(wú)標(biāo)記的CL法檢測(cè)胰蛋白酶活性。檢測(cè)線性范圍為0.02-10nM，檢測(cè)限可達(dá)7.3pM，并且能夠用于胰蛋白酶抑制劑的篩選。胰蛋白酶