電致化學發(fā)光法檢測人類甲基轉移酶(DNMT1)活性的研究.pdf

1、在哺乳動物的體內有三種不同的DNA甲基轉移酶，它們分別是DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，含量最豐富的是DNMT1，被認為是哺乳動物中最關鍵的甲基轉移酶。實驗表明DNA甲基轉移酶活性的異常與許多類型的遺傳缺陷和眾多的惡性腫瘤密切相關，DNA甲基轉移酶活性的異常會導致異常的DNA甲基化。目前，許多研究結果已經證明，低甲基化和超甲基化存在于多種癌癥中，像宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、泌尿道癌、白血病等。胞嘧啶的DNA的甲基化是最

2、常見的甲基化形式，其過程是在DNA甲基轉移酶催化下，將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團轉移到CpG位點的胞嘧啶上，該甲基化發(fā)生在嘧啶環(huán)的C5位上。最近研究表明了甲基轉移酶活性的異常通常比惡性腫瘤其他癥狀的發(fā)生要早許多，因此DNA甲基轉移酶是一種潛在的可預測的生物標記物，可作為不同類型的癌癥的診斷和治療過程中的藥物作用靶點。因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏且可用于實際樣品中甲基轉移酶活性的方法有著重要的意義。電致化學發(fā)光檢測法將電化學檢測和化學發(fā)光

3、檢測結合在一起，和化學發(fā)光法相比，它無需發(fā)射光源，實驗背景信號較低。具有高靈敏度、易操作、儀器易于小型化等優(yōu)點。本文利用電致化學發(fā)光法，實現了癌癥細胞中的人類DNA甲基轉移酶活性高靈敏的檢測。本課題旨在建立對某些疾病早期細胞的甲基化水平檢測的方法，為早期的診斷和治療提供理論依據。
　　1.建立了電致化學發(fā)光(ECL)生物傳感器來檢測癌細胞中甲基轉移酶(DNMT1)活性。在這個工作中，MPA修飾的摻Eu3+的CdS量子點(MPA-C

4、dS∶EuNCs)作為電致化學發(fā)光的發(fā)射體。修飾了MPA-CdS∶Eu NCs的玻碳(GCE)電極上連接半甲基化的雙鏈DNA，當與DNMT1和SAM作用后，半甲基化序列5'-CGCGCG-3'的胞嘧啶C被甲基化，形成全甲基化雙鏈DNA，之后再與限制性核酸內切酶BssHⅡ作用。經過BssHⅡ剪切后，半甲基化的雙鏈DNA上剩余的3'端凹陷的部分能夠繼續(xù)被ExoⅢ消化掉。留在電極上的單鏈DNA部分會與primeDNA進行雜交，這樣就引發(fā)了一個

5、雜交鏈反應。形成一個G-四聯體/血紅素DNA酶的超級雙鏈DNA結構，大大降低ECL的信號。因為BssHⅡ只能對半甲基化的序列進行剪切，因此，甲基轉移酶的活性越高，全甲基化雙鏈DNA越多，被剪切的越少。基于上述的過程，實現了對檢測細胞中的DNMT1活性的高靈敏度檢測。實驗結果表明，電致化學發(fā)光強度差（全甲基化之前與形成G-四聯體的DNA酶之后的強度差）與DNMT1的活性有很好的線性，在信噪比為3時，檢測限可達到0.09U/mL，而且該生物

6、傳感器可應用于人肺癌細胞(A549)中DNMT1的檢測，它的檢測限可達到2個A549細胞。為了驗證該實驗方法在臨床上的應用，進一步檢測了另外兩種癌癥細胞(人乳腺癌細胞MCF-7和人宮頸癌細胞Hela)和一種正常的人胚腎細胞(HKE-293)中的DNMT1的活性。結合DNMT1標準試劑盒實驗結果，以HKE-293為基準，其余細胞對DNMT1的相關性進行換算，結果表明人類癌癥細胞對于DNMT1是高表達的，在生物醫(yī)學的研究有著潛在價值。

7、>　　2.通過構建雙信號比率計算電致化學發(fā)光生物傳感器來檢測人類甲基轉移酶活性。該方法以CdS∶Eu NCs和魯米諾為信號發(fā)射體，其中CdS∶Eu NCs修飾在玻碳電極表面，而魯米諾存在于實驗檢測液中。首先，半甲基化的發(fā)卡S1DNA連接在修飾了CdS∶Eu NCs的玻碳電極上。之后將S2DNA與Au NPs共同作用形成了S2DNA-Au NP的結構與連接在GCE電極上的S1DNA進行雜交，形成了S1&S2/GCE的電極組裝結構。接下來，

8、DNMT1和SAM進行甲基化作用，其中一部分的半甲基化的雙鏈DNA全甲基化。因為限制性核酸內切酶BssHⅡ對甲基化敏感，只能剪切半甲基化或者未甲基化的5'-GCGCGC-3'序列，此時全甲基化的雙鏈DNA不能夠被接下來的限制性內切酶BssHⅡ進行剪切，其他沒有全甲基化的雙鏈DNA能夠被剪切。之后，與核酸外酶ExoⅢ進行作用，BssHⅡ作用后的半甲基化DNA雙鏈結構中鏈接了AuNP的S1DNA部分被消化成片段，AuNPs脫離電極?；贑d

9、S∶Eu NCs和Au NPs之間的RET-SPR作用，以及AuNPs作為生物傳感器的電傳感原件對電致化學發(fā)光劑魯米諾有優(yōu)越的催化作用，此時的CdS∶Eu NCs的強度有部分的恢復，而魯米諾的強度降低，通過CdS∶Eu NCs和魯米諾強度的比值來檢測DNMT1的活性實驗。實驗結果表明，該方法可以用來檢測DNMT1的活性，它的最低檢測限為0.07U/mL。比之傳統的單信號源方法更加的準確。實驗同樣可用于對甲基轉移酶抑制劑的評估，對抗癌藥物