丹參多酚對(duì)鐵過載引起的臍血造血細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用.pdf

1、目的:探討丹參多酚對(duì)鐵過載引起的臍血造血細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1．臍帶血單個(gè)核細(xì)胞（UC-MNCs）的分離及培養(yǎng)臍帶血：羥乙基淀粉=4:1的比例要求混合均勻，在室溫20-25℃條件下自然沉淀1.5小時(shí)。吸白膜層，按1:5的比例加NH4Cl紅細(xì)胞裂解液混勻，避光靜置10min，離心棄上清，1640培養(yǎng)液洗滌2遍后，采用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的1640的培養(yǎng)液）懸浮單個(gè)核細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整

2、至1×106/mL的細(xì)胞密度，并接種于12孔培養(yǎng)板中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
　　2．鐵過載細(xì)胞模型建立及細(xì)胞分組枸櫞酸鐵胺（FAC）組及丹參多酚低、中、高劑量組以FAC400μmol/L濃度建立鐵過載細(xì)胞模型，于培養(yǎng)第2天加入含上述濃度的FAC的培養(yǎng)液，此后每24小時(shí)使用1640培養(yǎng)液更換液體，制備鐵過載細(xì)胞模型，共在400μmol/L FAC中培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)第3天，丹參多酚低劑量組加入18

3、μg/mL丹參多酚、中劑量組加入50μg/mL丹參多酚、高劑量組加入160μg/mL丹參多酚，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)照組則不需要加任何試劑，常規(guī)培養(yǎng)96小時(shí)。
　　3．鐵過載細(xì)胞模型鑒定鈣熒光素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）是可對(duì)所有存活狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行檢測的試劑，其本身具有熒光標(biāo)記特性，可以很容易的進(jìn)入存活細(xì)胞的細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，calcein做為酯酶水解產(chǎn)物留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)強(qiáng)綠色熒光。Calcein不能透過細(xì)胞膜而滯留在胞

4、質(zhì)與鐵可逆性結(jié)合，從而使熒光淬滅。細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，收集FAC組、對(duì)照組細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌2次，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整至1×106/mL的細(xì)胞密度，加入calcein-AM，終濃度為0.125μmol/L，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS洗滌細(xì)胞2次后，在激發(fā)光波長為496nm，吸收光波長為516nm下采用流式儀，對(duì)每一組細(xì)胞檢測其平均熒光強(qiáng)度水平，經(jīng)測FAC組、對(duì)照組LIP熒光強(qiáng)度分別為（4

5、5.20±8.30）、（78.21±9.47），F(xiàn)AC組可變鐵池（LIP）熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，證實(shí)FAC組關(guān)于鐵過載的細(xì)胞模型成功建立。
　　4.細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激（ROS）水平根據(jù)試劑盒的相關(guān)說明完成操作，使用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）標(biāo)記臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，DCFH-DA為非熒光脂類可滲透性成分，進(jìn)入細(xì)胞，隨之被酯酶水解，生成產(chǎn)物DCFH，后者由于ROS的存在，被氧化成非滲透性熒光成分DCF，DCF具有的熒光強(qiáng)

6、度較胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS成正相關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，加入10 mmol/L的2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽，使其最終濃度達(dá)到1μmol/L，并加入10μlCD33-PE（或20μlGlyA-PE），分別標(biāo)記于粒細(xì)胞以及紅細(xì)胞。于37℃避光溫育20 min，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，于激發(fā)光波長488nm，吸收光波長為525nm條件下，采用流式儀分別檢測各實(shí)驗(yàn)組ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　5

7、.細(xì)胞凋亡率細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，依照試劑盒具體說明，按步驟完成操作，使臍血單個(gè)核得細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL。取100μL細(xì)胞懸浮液于流式管中，加5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL碘化丙啶，混合均勻后，予以日常室溫放置，并避光進(jìn)行孵育15 min，隨后采用流式儀對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本進(jìn)行凋亡率檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　6.細(xì)胞集落計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，收集各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的UC-MNCs，1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，后重新懸浮

8、細(xì)胞，并予以計(jì)數(shù)。在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行集落培養(yǎng)，每孔中設(shè)定甲基纖維素半固體培養(yǎng)基0.5 mL，加入各組 MNCs1×105個(gè)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14天后，分別在顯微鏡下對(duì)紅系祖細(xì)胞集落形成單位（CFU-E）、粒-單核系祖細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）、爆式紅系祖細(xì)胞集落形成單位（BFU-E）和混合祖細(xì)胞集落形成單位（CFU-mix）進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　結(jié)果:
　　① FAC組（703.16±54

9、.47）ROS水平較對(duì)照組（163.74±7.43）升高（p<0.05），丹參多酚的低劑量、中劑量、高劑量組（414.40±21.93；415.31±14.11；185.91±7.24）較FAC組ROS水平降低（p<0.05）。
　?、?FAC組細(xì)胞的凋亡增高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（p<0.05）。丹參多酚高劑量組與FAC組相比凋亡減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　③ FAC與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組細(xì)胞集落