DLX1對BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、為了研究同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員DLX1對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic proteins9，BMP9）作用于小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞iMEFs和小鼠成肌細(xì)胞C2C12，通過PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進(jìn)DLX1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)。過表達(dá)DLX1的重組腺病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞、iMEFs細(xì)胞和C2C12細(xì)胞，在

2、此基礎(chǔ)上再用BMP9腺病毒的條件培養(yǎng)基處理細(xì)胞，分別利用化學(xué)發(fā)光法和染色法定量和定性地檢測早期的成骨分化指標(biāo)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性，發(fā)現(xiàn)BMP9可以促進(jìn)細(xì)胞的ALP活性升高，并且在C3H10T1/2細(xì)胞中，DLX1可以促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP的活性。值得注意的是，在iMEFs細(xì)胞中，雖然BMP9可以誘導(dǎo)其ALP活性升高，但是DLX1對BMP9的誘導(dǎo)作用卻沒有明顯影響。而對C2C12細(xì)胞而

3、言，BMP9誘導(dǎo)的ALP活性會受到DLX1的抑制。用同樣的處理方式作用于C3H10T1/2細(xì)胞，分別使用Western Blot和PCR檢測成骨指標(biāo)Osteopontin(OPN)和Osteocalcin(OCN)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果顯示，BMP9可以促進(jìn)OPN和OCN的表達(dá)，而DLX1能進(jìn)一步增強(qiáng)BMP9對其表達(dá)的誘導(dǎo)作用。同樣的方法處理C3H10T1/2細(xì)胞和iMEFs細(xì)胞后，通過茜素紅染色檢測晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積，發(fā)現(xiàn)BM

4、P9可以誘導(dǎo)細(xì)胞的鈣鹽沉積增多，而且DLX1可以增強(qiáng)BMP9對其的誘導(dǎo)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DLX1對成骨分化的作用，采用腺病毒DLX1感染C3H10T1/2細(xì)胞，在BMP9的作用下，利用PCR技術(shù)檢測成骨分化的標(biāo)志性基因inhibitor of deifferentiation1(Id1)、Id2、Id3、Osterix、osteoprotegerin(OPG)、DLX5、connective tissue growth factor(

5、CTGF)和Runt-related transcription factor2（Runx2）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BMP9均可誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)，并且DLX1可以促進(jìn)BMP9對靶基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用。DLX1腺病毒和BMP9條件培養(yǎng)基作用于C3H10T1/2細(xì)胞后，通過檢測熒光素酶報告基因的活性和Western Blot來探索DLX1與Smad信號通路之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLX1和BMP9均可以增強(qiáng)Smad熒光素酶報告基因的活性，并且DLX1可以

6、促進(jìn)BMP9的作用;Western印跡顯示，DLX1不影響B(tài)MP9誘導(dǎo)的Smad1/5/8的磷酸化水平，兩者對總蛋白水平?jīng)]有影響。為了更全面地驗(yàn)證DLX1對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，構(gòu)建了4個DLX1的siRNA質(zhì)粒并將其成功包裝成腺病毒，用此腺病毒分別感染C3H10T1/2細(xì)胞，利用PCR和Western Blot驗(yàn)證其干擾是否有效，結(jié)果表明這4種腺病毒均能有效地干擾DLX1的表達(dá)。4種腺病毒采用不同感染效率的劑量分別處理C3H10

7、T1/2細(xì)胞，在BMP9作用的基礎(chǔ)上，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法和染色法檢測成骨分化指標(biāo)ALP的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4種siRNA腺病毒中，有兩種在低感染效率和高感染效率時對C3H10T1/2細(xì)胞中由BMP9誘導(dǎo)的ALP活性的作用不同:低感染效率時可以促進(jìn)其ALP活性，而高感染效率時對其活性的影響則表現(xiàn)為抑制。其他兩種腺病毒對C3H10T1/2細(xì)胞中BMP9誘導(dǎo)的ALP活性的影響均表現(xiàn)為抑制。上述結(jié)果表明DLX1能夠促進(jìn)由BMP9所誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞