生長激素在BMP9介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化中的作用.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是具有多項(xiàng)分化潛能的成體干細(xì)胞，能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞譜系。干細(xì)胞的成骨分化是一個(gè)復(fù)雜、調(diào)控嚴(yán)格的過程，這個(gè)過程受一系列內(nèi)源性和各種環(huán)境因子以及信號通路的影響。對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的研究，有望為臨床上治療骨缺損、骨折及骨不連等病癥提供新方案。
　　 在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早期，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenesis

2、Proteins，BMPs)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor，TGF)β超家族成員，是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的分泌型多功能蛋白，在細(xì)胞黏附、增殖、分化，骨骼發(fā)育和骨組織形成中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)人BMP家族至少存在15種成員，其中BMP2，BMP4，BMP6，BMP7和BMP9能有效地在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。BMP9是骨源性最強(qiáng)的BMP之一，同時(shí)也

3、是目前了解得最少的BMP之
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，用BMP9腺病毒(Ad-BMP9)感染MSCs后，收集細(xì)胞總RNA進(jìn)行微陣列分析，有大約40個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生明顯變化。其中，生長激素(Growth Hormone，GH)的表達(dá)上調(diào)最為顯著。這提示生長激素參與了BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程，并且可能在其中發(fā)揮重要作用。生長激素是由垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，通過與GH受體結(jié)合，或與胰島素樣生長因子Ⅰ(Insulin-lik

4、e Growth FactorⅠ，IGF-Ⅰ)相互作用，影響骨骼的發(fā)育和生長。為了揭示生長激素在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中扮演的角色，探討其中的分子機(jī)制，本研究首先構(gòu)建了GH過表達(dá)的質(zhì)粒，并包裝相應(yīng)的腺病毒，其次，在體外、器官培養(yǎng)和體內(nèi)三個(gè)層面上研究GH和BMP9對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，最后通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)和小分子抑制劑的使用探索其中的調(diào)控機(jī)制

5、。我們主要的研究內(nèi)容包括：
　　 ①從Thermo公司購買含有人GH基因片段的質(zhì)粒，酶切后將GH基因片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上。測序鑒定后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BJAdEasy細(xì)胞中進(jìn)行重組，并篩選陽性克隆。PacⅠ酶切將重組子線性化、純化，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝。將病毒命名為AdR..GH。
　　 ②C3H10T1/2細(xì)胞購買自ATCC公司，是常用的MSC細(xì)胞株。免疫熒光檢測C3H10T1/2問充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志

6、物的表達(dá)。結(jié)果顯示，C3H10T1/2表達(dá)MSC標(biāo)志物CD29/Integrinβ1，CD44，CD73，CD90/Thy-1，CD117/c-kit，BMPRⅡ，CD133/Proml，CD105/Endoglin和CD166/ALCAM。
　　 ③利用Ad-BMP9感染C3H10T1/2細(xì)胞，分別于感染后1、3、5、7天收集細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測GH的表達(dá)。結(jié)果顯示這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)GH的表達(dá)均顯著增強(qiáng)。免疫組織化學(xué)染色(

7、Immunohistochemistry，IHC)結(jié)果表明，GH在發(fā)育中長骨生長板的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組：Ad-GFP/Ad-RFP(對照組)，Ad-GFP/AdR-GH，Ad-BMP9/Ad-RFP，Ad-BMP9/AdR-GH，用這4組病毒分別刺激MSCs，并檢測成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物的表達(dá)。這些標(biāo)志物包括堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)，骨鈣素，骨橋蛋白和基質(zhì)的礦化作用(茜素紅染色

8、)。結(jié)果表明，GH本身不能啟動MSCs的成骨分化，而當(dāng)GH和BMP9共同作用時(shí)，成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)明顯強(qiáng)于其他3組，說明GH在體外能促進(jìn)BMP9介導(dǎo)的MSCs成骨分化。
　　 ④在器官培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，我們截取胚胎期E18.5天的小鼠后肢進(jìn)行培養(yǎng)，并利用上述4組病毒感染組織。將鈣黃綠素作為熒光指示劑加入培養(yǎng)基中追蹤骨發(fā)育過程，在病毒感染后2、4、8、12天測量記錄脛骨橫截面熒光面積。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)的BMP9能有效促進(jìn)

9、骨生成，但BMP9和GH組合的促進(jìn)效果更為顯著。蘇木精-伊紅(Haematoxylin and eosin，H&E)染色結(jié)果顯示，Ad-BMP9/AdR-GH組中肥大軟骨區(qū)域大于對照組。這些結(jié)果表明，GH能促進(jìn)BMP9介導(dǎo)的軟骨內(nèi)成骨。
　　 ⑤利用上述4組病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞36小時(shí)后，收集細(xì)胞注射到無胸腺裸鼠皮下。注射4周后，處死裸鼠，收集移植部位進(jìn)行微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Microcomputed Tomograp

10、hy，MicroCT)。通過Amira5.3軟件將掃描結(jié)果進(jìn)行三維重建并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。僅感染Ad-BMP9/Ad-RFP或Ad-BMP9/AdR-GH病毒的MSCs能生成異位骨，且BMP9和GH共同誘導(dǎo)的MSCs形成的異位骨骨量更多，骨密度更大。H&E染色以及骨鈣素、骨橋蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，BMP9誘導(dǎo)生成的異位骨中形成部分成熟的骨基質(zhì)和骨小梁，同時(shí)可觀察到未分化的間充質(zhì)祖細(xì)胞。而由BMP9和GH共同誘導(dǎo)生成的異位骨中存在更

11、多的成熟骨基質(zhì)和更大，更厚的骨小梁，未分化的間充質(zhì)祖細(xì)胞相對較少。Masson'sTrichrome染色結(jié)果顯示，GH增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的基質(zhì)礦化作用。
　　 ⑥在GH啟動子區(qū)域?qū)ふ壹俣ǖ腟mad結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此設(shè)計(jì)兩對PCR寡核苷酸序列用于ChIP分析。亞融合的C3H10T1/2細(xì)胞被AdGFP或AdBMP9感染30個(gè)小時(shí)。交聯(lián)細(xì)胞，超聲破碎基因組DNA，然后用抗Smad1/5/8抗體進(jìn)行免疫共沉淀。分別用兩對引物與獲得的基因組

12、DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗-Smad1/5/8抗體能拖下含有GH啟動子區(qū)域的基因組片段。表明GH是MSCs中BMP9誘導(dǎo)的Smad信號的一個(gè)下游靶點(diǎn)。在BMP9或BMP9/GH誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs中分別加入STAT3、STAT5、JAK的小分子抑制劑后，于第5、7天檢測ALP活性。結(jié)果表明，這幾種抑制劑均能有效地抑制BMP9介導(dǎo)的ALP活性，同時(shí)，BMP9和GH協(xié)同誘導(dǎo)的ALP活性也受到明顯抑制。此外，RT-PCR結(jié)果顯示，GH能