FGF2調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:分析FGF2對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCS)成骨分化的影響極其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:首先用Western blot檢測(cè)外源性FGF2或外源性BMP9是否影響MSCs細(xì)胞中內(nèi)源性BMP9或FGF2的蛋白表達(dá);然后以不同滴度的Ad-RFP和AdR-FGF2腺病毒感染細(xì)胞，并制備BMP9條件培養(yǎng)基，待Ad-RFP和AdR-FGF2腺病毒作用24h后加入BMP9條件培養(yǎng)基，觀察

2、成骨分化早期標(biāo)志物堿性磷酸酶(Alkaline phosphotase，ALP)的變化;用結(jié)晶紫染色分析FGF2和BMP9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖情況的影響;然后用茜素紅S染色的方法觀察成骨晚期標(biāo)志物鈣鹽沉積的變化;通過(guò)Western blot檢測(cè)成骨晚期標(biāo)志物骨橋蛋白(Osteopotin，OPN)和骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)的變化。
　　隨后，通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)FGF2對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨分化相關(guān)靶基因ID1、ID2、

3、ID3及成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的影響;Western blot檢測(cè)FGF2對(duì)BMP9誘導(dǎo)的Runx2蛋白表達(dá)的影響;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot檢測(cè)FGF2對(duì)BMP9活化的經(jīng)典Smad1/5/8信號(hào)途徑和非經(jīng)典MAPKs(p38和ERK1/2)的影響;最后PCR檢測(cè)FGF2對(duì)于BMP9成骨相關(guān)Ⅰ型受體ALK1和ALK2的影響。
　　最后，利用FGF2和BMP9重組腺病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2，利用

4、裸鼠皮下異位成骨實(shí)驗(yàn)FGF2對(duì)于BMP9觀察在裸鼠皮下異位成骨的情況，并用H&E、Alcian Blue、 Masson's Trichrome對(duì)骨組織切片進(jìn)行染色，觀察骨組織成熟度情況。
　　結(jié)果:Western blot檢測(cè)顯示外源性FGF2在間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10T1/2細(xì)胞中不會(huì)影響內(nèi)源性BMP9蛋白的表達(dá)（反之亦然）;而B(niǎo)MP9誘導(dǎo)的ALP活性隨著FGF2腺病毒感染滴度的不斷增高而逐漸下降;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示FGF2和

5、BMP9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖都有一定促進(jìn)作用，兩者同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)促進(jìn)作用更明顯;在另一種間充質(zhì)干細(xì)胞小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中，F(xiàn)GF2同樣可抑制其BMP9誘導(dǎo)的ALP活性，同時(shí)抑制了晚期成骨分化標(biāo)志物鈣鹽沉積，以及OPN和OCN的表達(dá)。
　　PCR結(jié)果顯示FGF2抑制了BMP9相關(guān)靶基因ID1、ID2、ID3及成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的基因表達(dá)，Western bl

6、ot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FGF2也同時(shí)抑制了關(guān)鍵的成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的蛋白表達(dá);FGF2和BMP9本身均可以激活MAPKs中的p38和ERK1/2信號(hào)通路，但是FGF2對(duì)于BMP9誘導(dǎo)的p38和ERK1/2的活化并無(wú)明顯影響;值得注意的是，F(xiàn)GF2可以抑制BMP9激活的經(jīng)典Smad1/5/8信號(hào)途徑，表現(xiàn)為BMP9誘導(dǎo)的SBE熒光素酶活性下降、及Smad1/5/8磷酸化水平下降;PCR結(jié)果顯示FGF2抑制了BMP9成骨相關(guān)相關(guān)Ⅰ型受體ALK1和