中華被毛孢胞外糖蛋白(HS002-Ⅱ)的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及免疫調(diào)節(jié)功能研究.pdf

1、糖蛋白在生物體內(nèi)種類繁多，分布廣泛，具有多方面生物功能。研究表明，糖鏈不僅在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、防止蛋白質(zhì)水解、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等方面作用明顯，還具有細(xì)胞識(shí)別、抗腫瘤、抗氧化、防衰老等功能，其在功能性食品和新型藥物開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，而且近年來(lái)諸多科研工作者對(duì)糖蛋白的藥理作用和保健功能進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，取得了一系列重要的成果。
　　 冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)性味甘、平入肺經(jīng)，功能益肺腎，止咳嗽，補(bǔ)

2、虛損、益精氣，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效，是一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，藥用歷史悠久，被譽(yù)為中藥三大寶之一。隨著中藥在世界上的普及和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，蟲(chóng)草的免疫調(diào)節(jié)活性被進(jìn)一步證實(shí)。雖然蟲(chóng)草具有復(fù)雜的生物活性，但對(duì)其免疫調(diào)節(jié)活性尚缺乏系統(tǒng)性研究。中華被毛孢(Hirsutellasinensis)是從天然蟲(chóng)草中分離得到的蟲(chóng)草菌之一，具有與冬蟲(chóng)夏草相似的生物學(xué)功能，在蟲(chóng)草天然資源稀缺的情況下，中華被毛孢完全可以作為冬蟲(chóng)夏草的替代品

3、。本文主要對(duì)中華被毛孢胞外糖蛋白HS002-Ⅱ的分離純化、結(jié)構(gòu)分析和免疫調(diào)節(jié)功能等三方面作了系統(tǒng)的分析。
　　 首先從中華被毛孢發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物中，利用DEAE-Sepharose FF陰離子柱層析及Sephacryl S-200凝膠柱層析等分離純化方法，獲得一種均一的糖蛋白組分HS002-Ⅱ，然后通過(guò)HPLC、SDS-PAGE方法檢測(cè)該糖蛋白組分的純度，初步確定了HS002-Ⅱ的相對(duì)分子量為44KDa，其中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量為

4、42.1％，總糖含量為57，9％，糖醛酸占總糖的15.8％；并通過(guò)HPLC、IR等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，確定了該糖蛋白分子含D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖六種單糖，氨基酸分析確定其含Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala等16種氨基酸。
　　 然后系統(tǒng)研究了HS002-Ⅱ的免疫調(diào)節(jié)功能，選擇小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為細(xì)胞模型。通過(guò)MTT、Griess reagent

5、、ELISA方法分別檢測(cè)該糖蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、釋放NO能力以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，HS002-Ⅱ在50μg/ml時(shí)就能顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，并能濃度依賴性增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的能力和分泌細(xì)胞因子TNF-α的能力。進(jìn)一步采用RT-PCR方法檢測(cè)其對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子及其信號(hào)分子mRNA表達(dá)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，HS002-Ⅱ能顯著上調(diào)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α和iNOS、

6、NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)，呈濃度依賴性關(guān)系。然后利用western-blot方法分析其對(duì)RAW264.7細(xì)胞IκB-α和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響，系統(tǒng)探討了HS002-Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞免疫調(diào)控作用的可能機(jī)制。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示：HS002-Ⅱ能顯著降低RAW264.7細(xì)胞胞漿內(nèi)IκB-α和NF-κB p65蛋白的水平，同時(shí)顯著增強(qiáng)核內(nèi)NF-κB p65蛋白的水平，表明HS002-Ⅱ能濃度依賴的激活RAW