茶樹(shù)抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)基因克隆及逆境脅迫下的表達(dá)特性與生理響應(yīng).pdf

1、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbateperoxidaseAPX)最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，它是一種存在于高等植物和真核藻類(lèi)中的亞鐵血紅素蛋白。近年來(lái)關(guān)于APX的研究發(fā)展較快，特別是APX作為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶，能夠清除植物葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和微體中過(guò)氧化氫(H2O2)的作用已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。APX比其它抗氧化酶對(duì)H2O2有更高的親和力，且葉綠體中尚未發(fā)現(xiàn)有清除H2O2的過(guò)氧化氫酶(CAT)，因此，葉綠體中的H2O2

2、主要是由APX清除的。所以，在逆境脅迫下，APX對(duì)于植物維持正常的光合能力具有重要的作用。
　　 茶樹(shù)原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，是一種喜溫暖，濕潤(rùn)氣候的的經(jīng)濟(jì)作物。而低溫和干旱等逆境脅迫一直是茶樹(shù)分布和產(chǎn)量的限制性因素。因此，茶樹(shù)抗寒性和抗旱性機(jī)制的研究也一直受到極大的關(guān)注。本研究從低溫誘導(dǎo)茶樹(shù)SSH文庫(kù)和茶樹(shù)全器官轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中分別篩選出1條APX的EST片段，以茶樹(shù)葉片為試驗(yàn)材料，克隆得到三個(gè)APX：微體型APX(Microbo

3、dyAPX)、葉綠體基質(zhì)型APX(ChloroplasticstromalAPX)和類(lèi)囊體APX(Chloroplasticthylakoid-boundAPX)，并對(duì)它們初步的生物信息學(xué)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR分析研究了不同類(lèi)型的APX在茶樹(shù)不同組織中以及自然越冬低溫期和干旱脅迫下的表達(dá)差異，并對(duì)不同茶樹(shù)品種的APX活性及其葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了測(cè)定。主要研究?jī)?nèi)容和試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.微體APX，

4、命名為CsmAPX，其中cDNA全長(zhǎng)為1158bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?67bp，編碼288個(gè)氨基酸，C-端具有定位于過(guò)氧化物酶體的跨膜結(jié)構(gòu)；類(lèi)囊體APX，命名為CstAPX，其cDNA全長(zhǎng)為1424bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?296bp，編碼由431個(gè)氨基酸，C-端具有定位于類(lèi)囊體的跨膜結(jié)構(gòu)；葉綠體基質(zhì)型APX，命名為CssAPX，cDNA全長(zhǎng)為1579bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?149bp，編碼一個(gè)由382個(gè)氨基酸，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。已將三個(gè)基因序列遞交到

5、GenBank，登錄號(hào)分別為：JQ011380、JQ740734和JQ011381。
　　 2.多序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)APX都含有植物抗壞血酸過(guò)氧化物酶的2個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域：活性位點(diǎn)和亞鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)。此外，sAPX和tAPX也都含有葉綠體型APX的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：(K-N-I-E-E-W-P)和(E-T-K-Y-T-K-D-G-P-G-[A|N]-P-G-G-Q-S)。進(jìn)化樹(shù)分析表明CsmAPX、CssAPX、CstAPX和

6、CscAPX(GenBank登錄號(hào)：EU547804)分屬于兩大類(lèi)。
　　 3.利用RT-PCR對(duì)CsmAPX、CssAPX、CstAPX和CscAPX在茶樹(shù)不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明CscAPX在根、莖和葉中分布均衡不具有組織特異性，而CsmAPX、CstAPX和CscAPX具有組織特異性且主要分布在葉片中。
　　 4.以茶樹(shù)品種“茶農(nóng)98”、“迎霜”和“舒茶甲”的一生年無(wú)性系茶苗為試驗(yàn)材料，對(duì)其越冬低溫

7、期間APX活性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及4種APX的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，品種問(wèn)的APX活性變化規(guī)律一致，先升后降，且均在1月份達(dá)到最大值；品種間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化規(guī)律一致，即Fv/Fm、Fm和Fv/Fo先降后升，F(xiàn)o先升后降；RT-PCR和qRT-PCR分析表明越冬低溫期間cAPX和sAPX的表達(dá)水平在12月和1月顯著上調(diào)，之后下降，而mAPX和tAPX上調(diào)程度較小。
　　 5.干旱脅迫下，三個(gè)品種的APX活性變化規(guī)律一致