Toll樣受體4產(chǎn)生的活性氧在急性酒精暴露誘發(fā)肝臟脂質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、目的:酒精性肝病是全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題。酒精性脂肪肝是其初期表現(xiàn),主要表現(xiàn)為肝臟中脂質(zhì)過度沉積。最近的研究證實,在酒精性脂肪肝發(fā)病過程中脂肪酸和甘油三酯合成增加是肝臟脂質(zhì)過度沉積的主要原因。而固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1是脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在酒精性脂肪肝發(fā)病過程中起重要作用。研究也發(fā)現(xiàn)急性酒精暴露誘導(dǎo)肝臟SREBP-1激活和肝臟脂質(zhì)沉積。另一方面,Toll樣受體(TLR)4在慢性酒精性脂肪肝中起重要作用已被證實

2、,但在急性酒精性脂肪肝中的作用尚不明確。本研究重點探討TLR4是否通過影響活性氧和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,繼而介導(dǎo)急性酒精對肝臟SREBP-1激活作用,促進(jìn)肝臟脂質(zhì)合成和脂質(zhì)沉積導(dǎo)致急性酒精性脂肪肝。
　　方法:本研究由四個實驗構(gòu)成。實驗一、探討TLR4在單劑量酒精暴露誘發(fā)小鼠肝臟SREBP-1c激活和脂質(zhì)沉積過程中的作用。將雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各12只分

3、別隨機分成酒精處理組和對照組,所有小鼠禁食2h后,酒精處理組小鼠單次灌胃給予4g/kg酒精,對照組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水,給予酒精12h后剖殺。取血清檢測甘油三酯(TG)及其脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)含量;稱量肝重,計算肝重/體重比;取肝臟組織制備冰凍切片用于油紅O染色,觀察小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積情況;其它肝臟組織-80℃保存,用qPCR技術(shù)檢測調(diào)控肝臟脂肪酸和TG合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c下游靶基因fas,acc,scd-1,dgat-

4、2mRNA水平,用TG檢測試劑盒檢測小鼠肝臟組織TG含量。為進(jìn)一步深入研究單次酒精暴露對小鼠肝臟SREBP-1c的動態(tài)影響,將雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各20只隨機分為5組:對照組、酒精處理0.5h組、酒精處理2h組、酒精處理6h組和酒精處理12h組。實驗中所有小鼠均禁食,酒精處理(0.5h、2h、6h和12h)各時點組小鼠分別在禁食(13.5h、12h、8h和2

5、h)后灌胃給予酒精(4g/kg),對照組灌胃給予等容量生理鹽水。所有小鼠禁食14h后剖殺,取肝臟組織用Westernblot技術(shù)檢測單劑量酒精暴露對小鼠肝臟SREBP-1c核蛋白水平的影響。實驗二、為研究單劑量酒精暴露是否激活肝臟PI3K/Akt信號。將12只雄性TLR4+/+小鼠隨機分成酒精處理組和對照組,所有小鼠禁食8h后,酒精處理組小鼠單次灌胃給予4g/kg酒精,對照組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水,給予酒精6h后剖殺。取血清測定胰島

6、素和葡萄糖水平,取肝臟組織-80℃保存用qPCR技術(shù)檢測肝臟irs-1和irs-2mRNA水平。取雄性TLR4+/+和TLR4-/-小鼠各20只,隨機分為5組:對照組、酒精處理0.5h組、酒精處理2h組、酒精處理6h組和酒精處理12h組。酒精處理(0.5h、2h、6h和12h)各時點組小鼠分別在禁食(13.5h、12h、8h和2h)后灌胃給予酒精(4g/kg),對照組灌胃給予等容量生理鹽水。所有小鼠禁食14h后剖殺,取肝臟組織用West

7、ern blot技術(shù)檢測單劑量酒精暴露對小鼠肝臟Akt蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響。實驗三、為探討單劑量酒精暴露對小鼠肝臟TLR4信號的影響。選取雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各20只,隨機分為5組:對照組、酒精處理0.5h組、酒精處理2h組、酒精處理6h組和酒精處理12h組。實驗中所有小鼠均禁食,酒精處理(0.5h、2h、6h和12h)各時點組小鼠分別在禁食(13.5

8、h、12h、8h和2h)后灌胃給予酒精(4g/kg),對照組灌胃給予等容量生理鹽水。所有小鼠禁食14h后剖殺,取部分肝臟組織勻漿用ELISA檢測肝臟中TNF-α水平,另一部分肝臟組織用Westernblot技術(shù)檢測單劑量酒精暴露對小鼠肝臟MyD88、NF-κBp65蛋白表達(dá)和IκBα磷酸化水平的動態(tài)影響。實驗四、為進(jìn)一步探討TLR4產(chǎn)生的活性氧在單劑量酒精暴露誘發(fā)肝臟SREBP-1c激活和脂質(zhì)沉積中的作用。將雄性TLR4+/+和TLR4

9、-/-小鼠各12只分別隨機分成酒精處理組和對照組,所有小鼠禁食12h后,酒精處理組小鼠單次灌胃給予4g/kg酒精,對照組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水。灌胃2h后剖殺所有小鼠,取肝臟組織-80℃保存用qPCR技術(shù)檢測肝臟NADPH氧化酶亞基p67phox,gp91phox,p22phox和p47phoxmRNA水平。為了深入研究PBN對酒精引起的肝臟脂肪沉積的影響,取16只雄性ICR小鼠隨機分為4組,即酒精處理組、PBN干預(yù)組、單純PBN組

10、和對照組。酒精處理組小鼠單次灌胃給予4g/kg酒精,對照組小鼠灌胃給予等容量生理鹽水,PBN干預(yù)組小鼠于給予酒精前30min和給予酒精后4h分別腹腔注射PBN(100mg/kg),單純PBN組于與PBN干預(yù)組小鼠對應(yīng)時點腹腔注射PBN(100mg/kg)。給予酒精12h后剖殺所有小鼠,取肝臟組織制備冰凍切片用于油紅O染色;其它肝臟組織-80℃保存檢測肝臟TG含量,用Western blot檢測肝臟SREBP-1c核蛋白水平。
　　

11、結(jié)果:酒精處理組ICR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝臟TLR4信號均被激活,但對C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠無明顯影響。與此相一致的是酒精處理使ICR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝臟發(fā)生了明顯的脂質(zhì)沉積,而對C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠無明顯影響。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示酒精處理顯著激活I(lǐng)CR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝臟SREBP-1,但對

12、C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠無明顯影響。進(jìn)一步深入的研究結(jié)果顯示單劑量酒精處理明顯激活C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝臟PI3K/Akt,而對C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠中無明顯影響。另外,單劑量酒精處理對C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠血清胰島素水平和肝臟血清胰島素底物irs-1和irs-2mRNA水平也無明顯影響。單劑量的酒精未升高肝臟炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。此外,酒精處理使C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠