腺苷預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后CX3CL1、GLT-1表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　通過體外分離、純化及鑒定SD大鼠來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte As)的方法，建立氧糖剝奪/復(fù)氧糖模型，探討缺氧復(fù)氧情況下，腺苷預(yù)處理誘導(dǎo)趨化因子(CX3CL1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(GLT-1)的表達(dá)情況，為臨床治療缺血性腦血管疾病奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞在皮層分布的特點(diǎn)，取出生24h內(nèi)的SD大鼠，剝離其腦膜和血管，通過機(jī)械吹打法和差

2、速貼壁的發(fā)法處理及進(jìn)行細(xì)胞傳代。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　2.對培養(yǎng)至第三代或第四代的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過免疫熒光法行膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶GFAP的鑒定。
　　3.在24孔板內(nèi)，將融合80％以上的第三代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，隨機(jī)分為正常組、模型組(OGD/R)及腺苷預(yù)處理組(ADO/R)。24h后細(xì)胞基本貼壁，且伸出突觸，貼壁后ADO/R組給予腺苷預(yù)處理，即用含100μM腺苷的DMEM預(yù)先處理細(xì)胞，24h后進(jìn)行氧糖剝

3、奪過程。正常組不進(jìn)行此過程，OGD/R組和ADO/R組在糖氧剝奪期均更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，把培養(yǎng)板蓋去掉，放入缺氧培養(yǎng)箱（含95％氮?dú)狻?％CO2）的中孵育。缺氧進(jìn)行5h后，OGD/R組和ADO/R組均更換為復(fù)耱DMEM培養(yǎng)基，移入正常細(xì)胞培養(yǎng)箱(含37℃、5％CO2)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。正常組細(xì)胞在正常培養(yǎng)箱（含37℃、5％CO2）中孵育。用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后的形態(tài)學(xué)變化。
　　4.在96孔板內(nèi)，以1×10

4、5個(gè)/mL的密度接種第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞，每孔為104個(gè)細(xì)胞數(shù)，待24h后細(xì)胞融合后，經(jīng)過氧糖剝奪處理后，用MTT法檢測各組細(xì)胞的活力。
　　5.在24孔板中接種上對數(shù)期生長的星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞融合后，棄掉培養(yǎng)液，然后隨機(jī)分組，各組細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪處理后，在相應(yīng)的各孔中加入1000μL培養(yǎng)基，在復(fù)氧復(fù)糖24h后，將各組細(xì)胞上清液收集出來，按照大鼠CX3CL1 ELISA試劑盒測定CX3CL1濃度。在450nm波長下，用酶標(biāo)儀測定吸光度

5、OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品大鼠CX3CL1的濃度。
　　6.用免疫熒光法檢測各組GLT-1的表達(dá)情況。
　　7.用Western blot的方法測GLT-1的表達(dá)水平。將各組氧糖剝奪復(fù)氧糖后的細(xì)胞進(jìn)行消化，在加蛋白裂解液，冰上裂解20分鐘，蛋白濃度測定后在加上樣緩沖液，經(jīng)過沸水變性5分鐘，在每孔中加40ug蛋白樣品進(jìn)行電泳，用PVDH膜轉(zhuǎn)膜，封閉以后經(jīng)1∶500的稀釋比例加入一抗，在4度冰箱過夜后，加HRP標(biāo)記的二抗，37

6、度孵育箱內(nèi)孵育1h，經(jīng)ECL顯影后，用GAPDH做內(nèi)參進(jìn)行對照，各組熒光條帶的吸光度值用ImageJ軟件分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目的蛋白GLT-1與內(nèi)參的比值。
　　8.數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來表示，用Spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析，用Turkey法行兩兩比較，采用a=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.氧糖剝奪5h復(fù)氧糖24h后

7、星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變:正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖241h后生長狀態(tài)良好，與之前相比無明顯的形態(tài)學(xué)改變;OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體因水腫變圓，形狀由不規(guī)則形變?yōu)樗笮?，突起明顯變短或消失;ADO/R組細(xì)胞有較輕的水腫改變。
　　3.MXT法細(xì)胞活性檢測表明:經(jīng)氧糖剝奪復(fù)氧糖24h后，OGD/R組細(xì)胞活性明顯下降;與正常組相比，OD值降低(P＜0.05)，說明細(xì)胞的活力下降是由細(xì)胞損傷或死亡引起的。較OGD/R組，ADO/R

8、組細(xì)胞活力較高，說明細(xì)胞活力受ADO影響(P＜0.05)。且兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1的測定結(jié)果顯示:氧糖剝奪復(fù)氧糖24h后細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度測定表明，OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞CX3CL1濃度顯著高于正常組(P＜0.05)，表明細(xì)胞缺氧缺糖損傷嚴(yán)重，釋放出大量的CX3CL1;ADO/R組與OGD/R組相比，CX3CL1濃度明顯降低(P＜0.05)，表明細(xì)胞損傷較OGD/

9、R組輕，CX3CL1的釋放量較少。比較細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度，三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　5.GLT-1免疫熒光結(jié)果顯示:正常組的胞膜與胞質(zhì)中熒光信號表達(dá)最強(qiáng);經(jīng)氧糖剝奪復(fù)糖氧后，OGD/R組胞膜熒光信號表達(dá)減弱;而胞質(zhì)中熒光強(qiáng)度表達(dá)弱且無顯著的變化。與OGD/R組相比，ADO/R組胞膜熒光強(qiáng)度降低但顯著高于OGD/R組。
　　6.Westernblot檢測氧糖剝奪/復(fù)糖后GLT-1的表達(dá)情

10、況顯示:正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪5h/復(fù)氧糖24h后GLT-1蛋白表達(dá)相對最高，ADO/R組次之，OGD/R組最低，三組間兩兩比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪復(fù)氧糖后受損嚴(yán)重;
　　2.星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度與其活性、CX3CL1的表達(dá)濃度呈對應(yīng)變化的關(guān)系;
　　3.腺苷預(yù)處理可減少氧糖剝奪復(fù)氧糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度，并使氧糖剝奪/復(fù)氧糖后谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋