Annexin-1在氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及遷移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)致殘率和致死率較高的疾病，有研究表明ANXA1（膜聯(lián)蛋白1，annexin-1）在腦缺血/再灌注損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，在腦缺血/再灌注損傷中被活化而對(duì)神經(jīng)元的損傷及修復(fù)中具有復(fù)雜的功能表現(xiàn)。本文以大鼠海馬腦片及BV-2細(xì)胞（膠質(zhì)瘤來(lái)源的小膠質(zhì)細(xì)胞系）為研究對(duì)象，研究ANXA1對(duì)腦缺血/再灌注引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及遷移的影響，以探討ANXA1的

2、神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　方法：海馬腦片培養(yǎng)并以氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）的方法構(gòu)建組織缺血再灌注模型；以NeuN標(biāo)記海馬神經(jīng)元，OX-42或 Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，用免疫熒光多重標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)ANXA1、甲酰肽受體（FPRs）在神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)；用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄BV-2細(xì)胞的跨細(xì)胞膜電流；用Transwell遷移法及劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)BV-2細(xì)胞的遷移能力；用免疫印跡技術(shù)（Western Blot）檢

3、測(cè)磷酸化α-catenin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、OGD/R誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元高表達(dá)ANXA1：免疫熒光顯示ANXA1在海馬腦片CA1、CA3和DG區(qū)均有表達(dá)。海馬腦片OGD2h、復(fù)糖復(fù)氧24h后，ANXA1在CA1、CA3和DG區(qū)表達(dá)均有所增加，與對(duì)照組相比，CA1區(qū)的ANXA1表達(dá)增加具有顯著性差異（p<0.01）。以NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光多重染色結(jié)果顯示， OGD/R處理后海馬腦片中

4、ANXA1與NeuN共標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量增多，與對(duì)照組相比，在CA1區(qū)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）；ANXA1與Iba1共標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示，OGD/R誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元高表達(dá)ANXA1。
　　2、OGD/R誘導(dǎo)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)ANXA1的受體FPRs：免疫熒光顯示FPRs在海馬腦片CA1、CA3和DG區(qū)均有表達(dá)；以NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，OX-42標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光多重染色結(jié)果顯示，F(xiàn)PRs與Ne

5、uN共標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目稀少， FPRs與OX-42共標(biāo)記數(shù)目占FPRs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)總量的45.5％以上。海馬腦片OGD2h、復(fù)灌24h后，與對(duì)照組相比，F(xiàn)PRs在海馬腦片各區(qū)的表達(dá)量顯著增加（p<0.01）。免疫熒光多重染色結(jié)果顯示，OGD/R處理后FPRs與OX-42共標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01），而FPRs與NeuN共標(biāo)記細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。結(jié)果提示， OGD/R誘導(dǎo)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)ANXA

6、1受體FPRs。
　　3、ANXA1經(jīng)由FPRs受體活化小膠質(zhì)細(xì)胞：以Iba1標(biāo)記活化小膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光顯示，OGD/R處理后海馬腦片CA1區(qū)Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，與對(duì)照組相比，其增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）。在OGD階段予以ANXA1模擬肽Ac2-26（1μM）處理能增加CA1區(qū)Iba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量；在此階段予以FPRs受體拮抗劑Boc1（4μM）處理則顯著減少I(mǎi)ba1免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，與單純OGD/R處理

7、組相比，其減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）。全細(xì)胞膜片鉗記錄的結(jié)果顯示：BV-2細(xì)胞在+40 mV及以上跨膜電壓引起的跨膜外向電流能被Ac2-26（3.3μM）處理明顯增強(qiáng)，而在-80 mV~-60 mV跨膜電壓范圍內(nèi)Ac2-26（3.3μM）處理能誘發(fā)跨膜內(nèi)向電流；不同細(xì)胞個(gè)體的全細(xì)胞跨膜電流對(duì)Ac2-26（3.3μM）處理的反應(yīng)有差異，全細(xì)胞跨膜電流明顯受Ac2-26處理影響的細(xì)胞占60%(21/35)。結(jié)果提示，OGD/R誘導(dǎo)小

8、膠質(zhì)細(xì)胞活化，ANXA1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有促進(jìn)作用。
　　4、ANXA1經(jīng)由FPRs促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移：用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞的遷移能力。Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Transwell下室加入1.32μM Ac2-26和13.2μM Ac2-26的處理均能顯著提高上室細(xì)胞向下室的遷移率，與未加Ac2-26組相比，其遷移率增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05, p<0.01）；ANXA1受體拮抗劑Boc

9、1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低細(xì)胞遷移率（p<0.05）；10μM Boc1處理對(duì)未加Ac2-26組的細(xì)胞遷移率均沒(méi)有顯著影響。劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， Ac2-26（13.2μM）處理能顯著提高BV-2細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移數(shù)量，與對(duì)照組相比具有顯著差異性（p<0.01）；Boc1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低細(xì)胞遷移數(shù)（p<0.05）；而B(niǎo)oc1（10μM）處理對(duì)未加Ac2-26組的細(xì)胞遷移數(shù)均無(wú)顯著影響。這些結(jié)

10、果提示：未做OGD/R處理時(shí)ANXA1能經(jīng)由FPRs誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。
　　對(duì)BV-2細(xì)胞進(jìn)行OGD處理2h、復(fù)糖復(fù)氧24h，Transwell遷移試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)均顯示， OGD/R處理顯著增加BV-2細(xì)胞遷移能力，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。與單純OGD/R處理組相比，在OGD/R處理過(guò)程中加入Boc-1（10μM）能顯著降低 BV-2細(xì)胞遷移能力（p<0.05），而在 OGD/R處理過(guò)程中加入 Ac2-26（1

11、.32μM）能進(jìn)一步增強(qiáng)BV-2細(xì)胞遷移能力（p<0.05），而加入Boc-1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的這種作用（p<0.05）。這些結(jié)果提示：OGD/R處理誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，而ANXA1在OGD/R處理過(guò)程中通過(guò)作用FPRs能增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力。
　　5、ANXA1通過(guò)CK2磷酸化α-catenin介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移：Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Ac2-26（1.32μM）處理BV-2細(xì)胞24 h能顯著

12、提高α-catenin（ser-641）磷酸化水平，與對(duì)照組相比其增加具有顯著性差異（p<0.05），CK2抑制劑TBB(40μM)能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低α-catenin磷酸化水平（p<0.05），TBB對(duì)未加Ac2-26組的α-catenin磷酸化水平無(wú)顯著影響。Transwell遷移試驗(yàn)顯示，TBB(40μM)能翻轉(zhuǎn)Ac2-26（1.32μM，加于下室）的作用，顯著降低BV-2細(xì)胞遷移率（p<0.05）；而 TBB對(duì)未

13、加 Ac2-26組的BV-2細(xì)胞遷移率無(wú)顯著影響。PKC抑制劑(GF109203X，2μM)、Raf抑制劑（TAK632，1μM)以及P38抑制劑（SB202190，0.1μM)處理均不能表現(xiàn) TBB的上述兩種翻轉(zhuǎn)效應(yīng)。結(jié)果提示 ANXA1通過(guò)激活CK2磷酸化α-catenin而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。
　　結(jié)論：OGD/R處理增強(qiáng)海馬腦片神經(jīng)元的ANXA1表達(dá)以及海馬腦片小膠質(zhì)細(xì)胞的FPRs表達(dá)；OGD/R處理能促進(jìn)海馬腦片 CA1