RNF126在腦膠質瘤細胞增殖中的作用及機制研究.pdf

1、在真核核細胞內主要啟動兩條途徑來誘導蛋白的降解:其一，溶酶體途徑，內化膜蛋白及被吞入胞內的外來蛋白的降解主要經此途徑;其二，非溶酶體途徑，此途徑主要指導將一些被泛素結合修飾后的胞內蛋白進行降解。泛素為76個氨基酸所構建的蛋白，典型的蛋白泛素化過程需要先后經過泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3的作用進行順序催化反應，研究發(fā)現E3決定了催化底物的特異性。在直接能源物質ATP參與下，泛素-蛋白酶體經泛素的修飾和引導，先后通過E1、

2、E2、E3多步驟復雜的酶促反應，最終使底物蛋白質的特異性氨基酸殘基被泛素所標記，從而完成了目標底物蛋白的泛素化。
　　研究表明，大量的蛋白轉錄后的修飾過程均是通過泛素來進行的。泛素發(fā)揮作用機制主要是經三步酶促反應后使其與靶向蛋白上的特定氨基酸殘基以共價鍵相聯接。具體來講，泛素激活酶E1使泛素活化，之后傳遞給泛素結合酶E2，最后通過泛素連接酶E3的連接作用實現泛素同底物蛋白的賴氨酸殘基結合，從而實現了底物蛋白的整體泛素化過程。其中，

3、E2決定泛素修飾反應類型，而E3具有底物特異性?；蚬こ炭茖W的進展使泛素化精細機制進一步展現，被確定的E1酶有2種，E2酶50余種而E3酶的種類已經多達600余種。E3酶系家族成員可被分為RING-finger家族及HECT(homologous to E6AP C terminus)家族，RING-finger家族的成員最多，其分子結構中所含的E2結合結構域均極其相似，也均發(fā)揮將活化泛素轉移、連接至靶蛋白氨基酸殘基的橋梁作用，該家族E

4、3自身不直接同泛素起作用。HECT家族成員E3具有HECT催化結構域，這使的該類E3不僅直接同E2相結合，更會通過其分子結構中保守Cys殘基同活化后的泛素經硫酯鍵相聯接，整體上看，E2將泛素活化后傳遞給E3，最后由E3將之呈遞給底物蛋白，使底物蛋白實現泛素化。隨著基因科學、分子生物學技術的飛速發(fā)展，越來越多的泛素連接酶被不斷發(fā)現，泛素化機制及其重要的生物學作用愈加引起相關學者的高度重視。
　　泛素水解蛋白系統(tǒng)是調節(jié)蛋白質降解的一個

5、重要途徑，由于降解異常導致癌蛋白的積累往往會促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，泛素連接酶被人們認為是分子靶向治療的一個重要靶點。截至目前，已經有多個針對泛素連接酶抑制劑被報道具有較好的抗腫瘤作用，如Mdm2(Mouse double minute2)和NEDD8-Activating Enzyme(NAE)的抑制劑等。
　　RNF126是環(huán)指泛素連接酶家族的一員，在其N末端包含一個鋅指結構域，在C末端包含一個環(huán)指結構域。已有研究表明RN

6、F126可能與腫瘤的發(fā)生密切相關，比如乳腺癌。我們的預實驗結果顯示RNF126在膠質瘤組織和正常腦組織表達存在較大差異，提示RNF126可能是調控膠質瘤發(fā)生的一個潛在蛋白。因此，RNF126在膠質瘤中的生物學作用和機制值得進一步研究。
　　第一部分 RNF126與p27在膠質瘤中的蛋白表達以及相關性研究
　　目的:觀察RNF126與p27于人正常腦組織及不同惡性級別的腦膠質瘤組織中表達情況，探究此兩種基因之間的表達相關性。<

7、br>　　方法:該部分的研究分成正常腦組織組、Ⅲ級腦膠質瘤組和Ⅳ級腦膠質瘤組共三個研究組，其中，正常腦組織標本均取自嚴重顱腦損傷后接受顱內減壓手術患者的正常腦組織。采用Western Blot法檢測人腦膠質瘤及正常腦組織內RNF126與p27的蛋白水平，其中膠質瘤和正常腦組織各7例，并進行統(tǒng)計學分析;并分析兩種基因表達的相關性。另外，應用Western Blot方法檢測了RNF26在不同惡性程度的膠質瘤細胞中的表達情況。
　　結果

8、:1.我們通過免疫印跡法分析了RNF26和p27在非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中的表達情況，結果發(fā)現:非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中均有RNF126蛋白的表達，而與非瘤腦組織相比，腦膠質瘤中RNF126蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而p27的表達則與RNF26呈現一定的負相關關系，相關系數r=-0.71。2.我們分析了RNF126在不同惡性程度的膠質瘤細胞系中的表達情況，結果顯示RNF26在不同惡性程度的膠質瘤細胞中存在差

9、異，惡性程度越高，RNF26的表達越高。
　　結論:1、RNF126和p27在非瘤腦組織及腦膠質瘤組織中均有表達。RNF126在腦膠質瘤中表達較非瘤組織中表達明顯增加，且與細胞周期負調控因子p27呈現負相關性。2、RNF26在惡性程度越高的膠質瘤細胞系表達越高。
　　第二部分 RNF126對腦膠質瘤細胞增殖的作用及其分子機制研究
　　目的:觀察RNF126對膠質瘤細胞增殖能力的影響，探索其中存在的分子作用機制，為膠質瘤

10、分子靶向治療尋找潛在新作用靶點。
　　方法:1.分子克隆技術構建LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126質粒，并包裝慢病毒侵染膠質瘤細胞，構建穩(wěn)定沉默和過表達RNF126的細胞系。2.在構建的穩(wěn)定細胞系中，進行EdU滲入實驗、集落形成實驗和MTT實驗檢測沉默和過表達RNF126的腦膠質瘤細胞增殖能力。3.運用免疫共沉淀技術和免疫印跡實驗檢測RNF126和p27的相互作用，以及p27的蛋白水平和泛素化水平的變化。
　

11、　結果:(1)通過免疫印跡實驗檢測RNF126沉默效率，免疫印跡實驗顯示轉染pLV-shRNF126＃1組細胞中RNF126沉默效果達80％以上。隨后應用LV-shRNF126和LV-GFP-RNF126質粒包裝慢病毒侵染膠質瘤細胞U251，免疫熒光觀察示侵染效率在90％以上且沉默效果良好，提示U251-shRNF126沉默細胞系構建成功。(2)為了驗證RNF126對腦膠質瘤細胞增殖的重要性，我們用U251-shRNF126及U251-

12、control細胞系進行了EdU實驗，EdU實驗結果顯示:U251-shRNF126增殖率較U251-control增殖率低57％。同時，利用U251-shRNF126及U251-control細胞系進行細胞集落形成實驗，其統(tǒng)計結果顯示:U251-shRNF126細胞較U251-control克隆形成能力明顯降低。另外，我們用U251-shRNF126及U251-control細胞系進行了MTT實驗，MTT實驗結果同EdU及集落形成實驗

13、研究結果一致，顯示沉默RNF126后細胞增殖能力明顯減弱。以上結果表明沉默RNF126后細胞增殖能力減弱，那么過表達RNF126后腦膠質瘤細胞增殖能力有何變化？為了進一步探討RNF126對細胞增殖的影響，我們包裝了GFP-RNF126和GFP慢病毒，并用慢病毒侵染U251細胞，構建U251-GFP-RNF126和U251-GFP細胞系。免疫熒光實驗顯示侵染效率在90％以上。為了檢測U251-GFP-RNF126細胞系中外源性RNF126

14、表達情況，我們提取U251-GFP-RNF126和U251-GFP細胞蛋白，通過Western Blot實驗檢測示RNF126在U251細胞中能穩(wěn)定表達，說明U251-GFP-RNF126和U251-GFP細胞系構建成功。為了進一步驗證RNF126促進膠質瘤細胞增殖的作用，我們通過對U251-GFP-RNF126及U251-GFP細胞系中進行EdU實驗。EdU檢測結果顯示U251-GFP-RNF126細胞增殖率較U251-GFP細胞增高

15、110％。通過對U251-GFP-RNF126及U251-GFP細胞系檢測細胞集落形成能力，其統(tǒng)計結果顯示:U251-GFP-RNF126細胞較U251-GFP細胞克隆形成能力明顯提高。MTT實驗也顯示U251-GFP-RNF126及U251-GFP較對照組增殖能力明顯增強。以上實驗結果表明RNF126可能在人腦膠質瘤細胞增殖中起著重要作用，沉默RNF126明顯抑制膠質瘤細胞增殖，過表達RNF126則明顯促進膠質瘤細胞增殖。(3)為進一

16、步探討RNF126究竟是通過何種分子機制來促進膠質瘤細胞增殖，我們首先在U251細胞中轉染FLAG-RNF126后，通過免疫共沉淀技術驗證了p27與RNF126的相互作用。實驗結果顯示在U251細胞中過表達RNF126可以與p27相互結合。進一步內源蛋白Co-IP證明細胞內源的RNF26同樣可以與p27相互作用。(4)然后我們又發(fā)現，沉默RNF126明顯上調p27的蛋白水平，而過表達RNF26則明顯下調p27的蛋白水平。相應地，沉默RN

17、F126明顯減弱p27的泛素化，而過表達RNF26則明顯增加p27的泛素化。最后我們證明RNF126介導的p27降解可以被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷。我們也試圖做了體外泛素化實驗，然而我們沒有檢測到p27的體外泛素化反應。這說明可能有其他一些因素參與到RNF126介導的p27泛素化過程中，比如p27的修飾，或者其他一些接頭蛋白等。總之，我們的研究闡明了RNF26在膠質瘤增殖中高表達，并且可以通過負調控細胞周期抑制子p27促進膠質瘤細胞