不同活化亞型的巨噬細胞在非小細胞肺癌免疫逃逸中的作用初探.pdf

1、背景與目的：
　　巨噬細胞作為一種異質性的細胞群體，在不同的微環(huán)境中表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)，被賦予明顯不同的功能。M1型巨噬細胞通過參與正向免疫應答發(fā)揮抗感染和抗腫瘤的功能，而M2型巨噬細胞下調免疫應答，介導病原體和腫瘤的免疫逃逸。在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中巨噬細胞的活化狀態(tài)如何，與機體的局部及全身免疫狀態(tài)關系如何，其活化狀態(tài)受哪些因素調控尚未見文獻報道。本課題通過流式細胞儀檢測非小細胞肺癌外周血、腫瘤組織及癌旁組織M1及M2巨噬

2、細胞標志性分子;同時比較腫瘤不同部位巨噬細胞功能差異以明確非小細胞肺癌巨噬細胞的活化狀態(tài)。免疫組化進一步檢測癌組織和癌旁組織中巨噬細胞不同活化狀態(tài)標志分子的表達，研究非小細胞肺癌巨噬細胞活化與預后及臨床病理參數(shù)的關系。通過檢測細胞因子、免疫細胞標志分子的表達，研究其與巨噬細胞不同活化狀態(tài)的關系，探討巨噬細胞發(fā)生不同活化的可能機制。最后通過體外實驗探討細胞因子對巨噬細胞活化的影響及非小細胞肺癌發(fā)生免疫逃逸的可能機制。
　　材料與方法

3、：
　　1.用流式細胞術檢測10例健康對照外周血和22例非小細胞肺癌患者外周血、腫瘤組織、瘤旁組織中CD16+CD14+和B7-H1+CD14+的巨噬細胞表達情況，分析不同亞型巨噬細胞與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系。
　　2.用巨噬細胞吞噬功能測定比較腫瘤內和腫瘤旁組織分離出的巨噬細胞功能差異。
　　3.用免疫組織化學通過對腫瘤原位巨噬細胞分子標志CD68、M1型巨噬細胞標志分子TNFα、CD16及M2型巨噬細胞標志

4、分子CD206、B7-H1進行定量及定性分析，研究其與非小細胞肺癌的臨床病理參數(shù)和預后的關系。
　　4.用免疫組織化學方法對非小細胞肺癌的細胞因子IL-10、TGF-β1，免疫細胞如調節(jié)性T細胞、NK細胞、PD-1+淋巴進行定量及定性分析，以探討腫瘤局部免疫狀態(tài)與巨噬細胞活化表型的關系，分析細胞因子對巨噬細胞活化狀態(tài)的影響。
　　5.免疫組化檢測IL-10在人肺癌細胞株A549的表達。體外實驗通過對人血源性巨噬細胞進行誘導培

5、養(yǎng)，觀察空白對照、IFN-γ+LPS、IL-10，人肺癌細胞株A549的細胞培養(yǎng)上清，A549的細胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體五種不同刺激因子對巨噬細胞表型和功能的影響。流式細胞術檢測不同誘導組巨噬細胞表型區(qū)別;ELISA細胞因子檢測、巨噬細胞吞噬功能檢測、MTT法同種異體混合淋巴細胞反應檢測比較不同誘導組巨噬細胞功能區(qū)別，以探討IL-10對巨噬細胞活化的影響。
　　結果：
　　1.非小細胞肺癌巨噬細胞活化亞型的表型和功能

6、
　　(1)非小細胞肺癌患者外周血B7-H1+CD14+細胞占CD14+單核細胞比例為3.91±1.54％高于健康對照組外周血2.13±0.86％(P＜0.05);腫瘤組織內B7-H1+CD14+細胞占CD14+巨噬細胞比例為42.88±3.52％顯著高于癌旁組織17.76±2.74％(P＜0.001)，腫瘤組織中的B7-H1+CD14+的平均熒光強度119.40±18.56％高于癌旁組織45.86±9.86％(P＜0.001)。

7、
　　(2)非小細胞肺癌患者外周血CD16+CD14+細胞占CD14+單核細胞比例為20.35±3.54％高于健康對照組外周血10.49±1.82％(P＜0.001);腫瘤組織中CD16+CD14+細胞占CD14+巨噬細胞比例為7.76±2.38％顯著低于癌旁組織17.76±2.52％(P＜0.001);腫瘤組織中的CD16+的平均熒光強度35.63±1.76％低于癌旁組織45.86±2.35％(P＜0.05)。
　　(3)

8、腫瘤內B7-H1+CD14+細胞比例和CD16+CD14+細胞比例與臨床分期、腫瘤大小有關，與年齡、性別、組織學分級、組織學類型，淋巴結轉移無關。
　　(4)腫瘤內巨噬細胞吞噬雞紅細胞百分率30.21±1.73％低于腫瘤旁巨噬細胞吞噬雞紅細胞百分率38.11±2.35％(P＜0.05)。腫瘤內巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)0.86±0.09低于腫瘤旁巨噬細胞吞噬雞紅細胞吞噬指數(shù)0.97±0.15(P＜0.05)。
　　2.非小

9、細胞肺癌巨噬細胞活化亞型的臨床意義
　　TNF-α陽性巨噬細胞在癌組織內陽性率21.28％顯著低于交界區(qū)48.93％及癌旁肺組織42.10％(P＜0.05)。CD16陽性巨噬細胞在癌組織內陽性率34.04％顯著低于交界區(qū)51.16％及癌旁肺組織78.94％(P＜0.05)。CD206陽性巨噬細胞在癌組織內陽性率65.95％、交界區(qū)陽性率74.41％均顯著高于癌旁肺組織陽性率36.84％(P＜0.05)。B7-H1在癌組織內陽性率4

10、8.93％、癌邊緣為74.41％均顯著高于癌旁肺組織陽性率31.57％(P＜0.05)。腫瘤組織內TNFα、CD16蛋白的表達與非小細胞肺癌患者的臨床分期負相關，與生存期呈正相關。腫瘤組織內CD206、B7-H1蛋白的表達與非小細胞肺癌患者臨床分期正相關，B7-H1蛋白的表達與生存期呈負相關。腫瘤內M1型和M2型巨噬細胞可以作為獨立預測非小細胞肺癌患者預后的指標。
　　3.非小細胞肺癌微環(huán)境與巨噬細胞亞型的關系
　　(1)

11、IL-10在非小細胞肺癌癌細胞陽性率70.21％高于癌旁肺組織肺泡上皮細胞陽性率26.31％(P＜0.05)。IL-10蛋白的表達與患者臨床分期正相關、與生存期負相關。IL-10的表達水平和腫瘤內M1型巨噬細胞標志分子表達呈負相關，與腫瘤內M2型巨噬細胞標志分子表達的正相關。
　　(2)腫瘤內CD56+的NK細胞數(shù)量低于癌旁組織。腫瘤內FoxP3+的調節(jié)性T淋巴細胞及PD-1+的淋巴細胞的數(shù)量高于癌旁組織，腫瘤內FoxP3+的調節(jié)

12、性T淋巴細胞數(shù)量在M2型巨噬細胞標志蛋白表達陽性組明顯高于陰性組，在M1型巨噬細胞標志蛋白表達陽性組與陰性組之間無明顯差別。
　　4.體外實驗探討IL-10對巨噬細胞活化亞型的影響
　　(1) IL-10在人肺癌細胞株A549陽性表達
　　(2)經(jīng)LPS+IFN-γ刺激后，巨噬細胞高表達等M1型巨噬細胞相關標志CD16、TNFα，同時巨噬細胞吞噬功能及刺激淋巴細胞增殖功能均較空白對照組提高;經(jīng)IL-10和人肺癌細胞株A

13、549的細胞培養(yǎng)上清刺激后，巨噬細胞高表達M2型巨噬細胞相關標志B7-H1、IL-1ra，同時巨噬細胞吞噬功能及刺激淋巴細胞增殖功能均較空白對照組及A549的細胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體組降低。A549的細胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體刺激后可部分降低IL-10對巨噬細胞吞噬功能及刺激淋巴細胞增殖功能的影響。IL-10參與了巨噬細胞向M2型巨噬細胞活化。
　　結論：
　　1.在非小細胞肺癌中同時存在著M1型巨噬細胞和M2

14、型巨噬細胞。在肺癌組織的不同部位兩型細胞的比例各不相同，在腫瘤內以M2型巨噬細胞為主，在腫瘤周圍肺組織以M1型巨噬細胞為主。且兩型巨噬細胞相關蛋白表達與腫瘤分期及預后相關。提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤巨噬細胞的類型發(fā)生了改變:在腫瘤的早期，巨噬細胞以M1型為主，而在腫瘤的晚期，以M2型為主。腫瘤內M1型和M2型巨噬細胞可以作為獨立預測非小細胞肺癌患者預后的指標。
　　2.CD56、FoxP3及PD-1蛋白表達結果均顯示，腫瘤內

15、處于一種免疫抑制的狀態(tài)，腫瘤內FoxP3+的調節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量在M2型巨噬細胞標志蛋白表達陽性組明顯高于陰性組，M2型巨噬細胞可能通過提高調節(jié)性T細胞數(shù)量促進非小細胞肺癌免疫逃逸。
　　3.非小細胞肺癌中癌細胞表達IL-10，與M1型巨噬細胞標志分子表達負相關，與M2型巨噬細胞標志分子表達正相關。提示抑制性細胞因子IL-10可能是誘導巨噬細胞表型改變的重要因素。
　　4.人肺癌細胞株A549表達IL-10，人重組IL-10