不同活化亞型的巨噬細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌免疫逃逸中的作用初探.pdf

1、背景與目的：
　　巨噬細(xì)胞作為一種異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在不同的微環(huán)境中表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)，被賦予明顯不同的功能。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)參與正向免疫應(yīng)答發(fā)揮抗感染和抗腫瘤的功能，而M2型巨噬細(xì)胞下調(diào)免疫應(yīng)答，介導(dǎo)病原體和腫瘤的免疫逃逸。在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)如何，與機(jī)體的局部及全身免疫狀態(tài)關(guān)系如何，其活化狀態(tài)受哪些因素調(diào)控尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌外周血、腫瘤組織及癌旁組織M1及M2巨噬

2、細(xì)胞標(biāo)志性分子;同時(shí)比較腫瘤不同部位巨噬細(xì)胞功能差異以明確非小細(xì)胞肺癌巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)。免疫組化進(jìn)一步檢測(cè)癌組織和癌旁組織中巨噬細(xì)胞不同活化狀態(tài)標(biāo)志分子的表達(dá)，研究非小細(xì)胞肺癌巨噬細(xì)胞活化與預(yù)后及臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)，研究其與巨噬細(xì)胞不同活化狀態(tài)的關(guān)系，探討巨噬細(xì)胞發(fā)生不同活化的可能機(jī)制。最后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討細(xì)胞因子對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響及非小細(xì)胞肺癌發(fā)生免疫逃逸的可能機(jī)制。
　　材料與方法

3、：
　　1.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)10例健康對(duì)照外周血和22例非小細(xì)胞肺癌患者外周血、腫瘤組織、瘤旁組織中CD16+CD14+和B7-H1+CD14+的巨噬細(xì)胞表達(dá)情況，分析不同亞型巨噬細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　2.用巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定比較腫瘤內(nèi)和腫瘤旁組織分離出的巨噬細(xì)胞功能差異。
　　3.用免疫組織化學(xué)通過(guò)對(duì)腫瘤原位巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD68、M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子TNFα、CD16及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志

4、分子CD206、B7-H1進(jìn)行定量及定性分析，研究其與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。
　　4.用免疫組織化學(xué)方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1，免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、PD-1+淋巴進(jìn)行定量及定性分析，以探討腫瘤局部免疫狀態(tài)與巨噬細(xì)胞活化表型的關(guān)系，分析細(xì)胞因子對(duì)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的影響。
　　5.免疫組化檢測(cè)IL-10在人肺癌細(xì)胞株A549的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人血源性巨噬細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培

5、養(yǎng)，觀察空白對(duì)照、IFN-γ+LPS、IL-10，人肺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞培養(yǎng)上清，A549的細(xì)胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體五種不同刺激因子對(duì)巨噬細(xì)胞表型和功能的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞表型區(qū)別;ELISA細(xì)胞因子檢測(cè)、巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)、MTT法同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)比較不同誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞功能區(qū)別，以探討IL-10對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.非小細(xì)胞肺癌巨噬細(xì)胞活化亞型的表型和功能

6、
　　(1)非小細(xì)胞肺癌患者外周血B7-H1+CD14+細(xì)胞占CD14+單核細(xì)胞比例為3.91±1.54％高于健康對(duì)照組外周血2.13±0.86％(P＜0.05);腫瘤組織內(nèi)B7-H1+CD14+細(xì)胞占CD14+巨噬細(xì)胞比例為42.88±3.52％顯著高于癌旁組織17.76±2.74％(P＜0.001)，腫瘤組織中的B7-H1+CD14+的平均熒光強(qiáng)度119.40±18.56％高于癌旁組織45.86±9.86％(P＜0.001)。

7、
　　(2)非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD16+CD14+細(xì)胞占CD14+單核細(xì)胞比例為20.35±3.54％高于健康對(duì)照組外周血10.49±1.82％(P＜0.001);腫瘤組織中CD16+CD14+細(xì)胞占CD14+巨噬細(xì)胞比例為7.76±2.38％顯著低于癌旁組織17.76±2.52％(P＜0.001);腫瘤組織中的CD16+的平均熒光強(qiáng)度35.63±1.76％低于癌旁組織45.86±2.35％(P＜0.05)。
　　(3)

8、腫瘤內(nèi)B7-H1+CD14+細(xì)胞比例和CD16+CD14+細(xì)胞比例與臨床分期、腫瘤大小有關(guān)，與年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
　　(4)腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞百分率30.21±1.73％低于腫瘤旁巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞百分率38.11±2.35％(P＜0.05)。腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)0.86±0.09低于腫瘤旁巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)0.97±0.15(P＜0.05)。
　　2.非小

9、細(xì)胞肺癌巨噬細(xì)胞活化亞型的臨床意義
　　TNF-α陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在癌組織內(nèi)陽(yáng)性率21.28％顯著低于交界區(qū)48.93％及癌旁肺組織42.10％(P＜0.05)。CD16陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在癌組織內(nèi)陽(yáng)性率34.04％顯著低于交界區(qū)51.16％及癌旁肺組織78.94％(P＜0.05)。CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在癌組織內(nèi)陽(yáng)性率65.95％、交界區(qū)陽(yáng)性率74.41％均顯著高于癌旁肺組織陽(yáng)性率36.84％(P＜0.05)。B7-H1在癌組織內(nèi)陽(yáng)性率4

10、8.93％、癌邊緣為74.41％均顯著高于癌旁肺組織陽(yáng)性率31.57％(P＜0.05)。腫瘤組織內(nèi)TNFα、CD16蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床分期負(fù)相關(guān)，與生存期呈正相關(guān)。腫瘤組織內(nèi)CD206、B7-H1蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床分期正相關(guān)，B7-H1蛋白的表達(dá)與生存期呈負(fù)相關(guān)。腫瘤內(nèi)M1型和M2型巨噬細(xì)胞可以作為獨(dú)立預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。
　　3.非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境與巨噬細(xì)胞亞型的關(guān)系
　　(1)

11、IL-10在非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞陽(yáng)性率70.21％高于癌旁肺組織肺泡上皮細(xì)胞陽(yáng)性率26.31％(P＜0.05)。IL-10蛋白的表達(dá)與患者臨床分期正相關(guān)、與生存期負(fù)相關(guān)。IL-10的表達(dá)水平和腫瘤內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)的正相關(guān)。
　　(2)腫瘤內(nèi)CD56+的NK細(xì)胞數(shù)量低于癌旁組織。腫瘤內(nèi)FoxP3+的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞及PD-1+的淋巴細(xì)胞的數(shù)量高于癌旁組織，腫瘤內(nèi)FoxP3+的調(diào)節(jié)

12、性T淋巴細(xì)胞數(shù)量在M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)陽(yáng)性組明顯高于陰性組，在M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組之間無(wú)明顯差別。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)探討IL-10對(duì)巨噬細(xì)胞活化亞型的影響
　　(1) IL-10在人肺癌細(xì)胞株A549陽(yáng)性表達(dá)
　　(2)經(jīng)LPS+IFN-γ刺激后，巨噬細(xì)胞高表達(dá)等M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD16、TNFα，同時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬功能及刺激淋巴細(xì)胞增殖功能均較空白對(duì)照組提高;經(jīng)IL-10和人肺癌細(xì)胞株A

13、549的細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激后，巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志B7-H1、IL-1ra，同時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬功能及刺激淋巴細(xì)胞增殖功能均較空白對(duì)照組及A549的細(xì)胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體組降低。A549的細(xì)胞培養(yǎng)上清加IL-10中和抗體刺激后可部分降低IL-10對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能及刺激淋巴細(xì)胞增殖功能的影響。IL-10參與了巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞活化。
　　結(jié)論：
　　1.在非小細(xì)胞肺癌中同時(shí)存在著M1型巨噬細(xì)胞和M2

14、型巨噬細(xì)胞。在肺癌組織的不同部位兩型細(xì)胞的比例各不相同，在腫瘤內(nèi)以M2型巨噬細(xì)胞為主，在腫瘤周?chē)谓M織以M1型巨噬細(xì)胞為主。且兩型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)。提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤巨噬細(xì)胞的類(lèi)型發(fā)生了改變:在腫瘤的早期，巨噬細(xì)胞以M1型為主，而在腫瘤的晚期，以M2型為主。腫瘤內(nèi)M1型和M2型巨噬細(xì)胞可以作為獨(dú)立預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。
　　2.CD56、FoxP3及PD-1蛋白表達(dá)結(jié)果均顯示，腫瘤內(nèi)

15、處于一種免疫抑制的狀態(tài)，腫瘤內(nèi)FoxP3+的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量在M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)陽(yáng)性組明顯高于陰性組，M2型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌免疫逃逸。
　　3.非小細(xì)胞肺癌中癌細(xì)胞表達(dá)IL-10，與M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)負(fù)相關(guān)，與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)正相關(guān)。提示抑制性細(xì)胞因子IL-10可能是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型改變的重要因素。
　　4.人肺癌細(xì)胞株A549表達(dá)IL-10，人重組IL-10