OxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Nogo-B表達(dá)上調(diào)及其機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。研究表明AS是一種慢性炎癥反應(yīng)。在AS斑塊區(qū)存在大量由單核巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的泡沫細(xì)胞。大量數(shù)據(jù)表明泡沫細(xì)胞與斑塊區(qū)的炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、自噬等密切相關(guān)。促進(jìn)泡沫細(xì)胞中脂質(zhì)的外排，抑制AS斑塊區(qū)的炎癥反應(yīng)成為治療AS斑塊的可能途徑。
　　 Nogo-B是Nogo(Neurite outgrowth inhi

2、bitor)的三個(gè)亞型之一，屬于Reticulon(RTN)蛋白家族。RTN蛋白是一類定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白家族，功能涉及管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成，維持膜曲率。Nogo-B在體內(nèi)分布廣泛，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞中高表達(dá)。Nogo-B參與了血管損傷后的重構(gòu)，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和炎癥細(xì)胞的募集。在AS斑塊區(qū)Nogo-B水平隨著斑塊發(fā)展逐漸降低，這可能促進(jìn)了AS進(jìn)程。盡管斑塊區(qū)Nogo-B整體水平下降，但是Nogo-B依然在斑塊區(qū)巨噬

3、細(xì)胞中高表達(dá)。斑塊區(qū)巨噬細(xì)胞不斷吞噬修飾的低密度脂蛋白，尤其是氧化的低密度脂蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞中大量脂質(zhì)堆積而逐步泡沫化，促進(jìn)了斑塊的發(fā)展。然而Nogo-B在巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中發(fā)揮的作用還不清楚。我們利用oxLDL體外刺激巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞模型，研究了Nogo-B在巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中發(fā)揮的功能，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的角度闡述了Nogo-B的抗AS作用。
　　 方法與結(jié)果:
　　 為了研究oxLDL對(duì)Nogo-B表達(dá)的影響

4、，我們利用oxLDL刺激巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，運(yùn)用Western blot及Realtime PCR法檢測(cè)Nogo-B蛋白以及mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明oxLDL提高了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中Nogo-B mRNA和蛋白水平。
　　 為了尋找oxLDL誘導(dǎo)Nogo-B上調(diào)的機(jī)制，我們利用ATF-6 siRNA干擾ATF-6的表達(dá)，檢測(cè)ATF-6 knockdown之后對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的Nogo-B表達(dá)的影響。首先利

5、用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活因子ATF-6，發(fā)現(xiàn)oxLDL誘導(dǎo)了RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ATF-6激活。接著利用siRNA干擾ATF-6的表達(dá)后，給予oxLDL刺激，我們發(fā)現(xiàn)oxLDL不能誘導(dǎo)ATF-6 knockdown細(xì)胞中Nogo-B的表達(dá)，表明oxLDL誘導(dǎo)的Nogo-B表達(dá)上調(diào)是通過(guò)ATF-6介導(dǎo)的。
　　 為了檢測(cè)Nogo-B上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，我們利用siRNA干擾Nogo-B的表達(dá)后，再給予oxLDL刺激

6、，比較對(duì)照組與Nogo knockdown組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。Nogoknockdown組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK、eIF2α、JNK磷酸化水平均上升。表明Nogo-Bknockdown增強(qiáng)了oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 OxLDL刺激RAW264.7細(xì)胞24h后，細(xì)胞中出現(xiàn)較強(qiáng)的自噬水平，LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1水平上升。免疫熒光結(jié)果也顯示oxLDL刺激后的細(xì)胞中出現(xiàn)較多的LC3熒光點(diǎn)。利用siRNA干擾N

7、ogo-B的表達(dá)后，給予oxLDL誘導(dǎo)自噬，比較Nogo knockdown細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞自噬水平的差異。透射電鏡結(jié)果顯示Nogo knockdown細(xì)胞中自噬泡增多。Western blot結(jié)果顯示Nogo knockdown提高了LC3-Ⅱ和p62蛋白水平，但是添加氯喹處理后LC3-Ⅱ變化不明顯，表明LC3-Ⅱ增多可能是自噬溶酶體降解途徑受阻。
　　 為了進(jìn)一步確定p62蛋白升高的原因是自噬性降解受到抑制還是蛋白表達(dá)增多，

8、我們檢測(cè)了oxLDL刺激后的細(xì)胞中p62蛋白以及p62 mRNA水平的變化。Western blot和Realtime PCR結(jié)果顯示，隨著oxLDL刺激時(shí)間的增加，Nogo knockdown組p62蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，而p62 mRNA水平?jīng)]有明顯差異。這一現(xiàn)象表明Nogo knockdown抑制了p62的降解。我們又分析了Nogo-B knockdown對(duì)細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平的影響，Nogo-B knockdown組細(xì)胞中p62

9、水平以及LC3-Ⅱ水平略高于對(duì)照組，給予氯喹處理后，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組間p62水平和LC3-Ⅱ水平?jīng)]有明顯差異。表明Nogoknockdown也影響了細(xì)胞基礎(chǔ)自噬。
　　 利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)比較Nogo knockdown是否影響了巨噬細(xì)胞對(duì)DiI-oxLDL的吞噬能力，Nogo knockdown巨噬細(xì)胞對(duì)DiI-oxLDL的吞噬能力與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。RAW264.7細(xì)胞吞噬DiI-oxLDL12h后，再利用3

10、-MA和Rapamycin處理12h，激光共聚焦顯微鏡下觀察到3-MA處理后的細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒明顯多于對(duì)照組，而Rapamycin處理后細(xì)胞內(nèi)熒光明顯弱于對(duì)照組，表明自噬促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的清除。我們發(fā)現(xiàn)Nogo knockdown組細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒也多于對(duì)照組細(xì)胞，而且Nogo knockdown細(xì)胞中脂滴表面特異蛋白Adipophilin蛋白水平明顯高于對(duì)照組，表明Nogo knockdown抑制了泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的清除。
　　 巨

11、噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nogo-B之后，給予oxLDL刺激24h，Nogo-B過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中Adipophilin蛋白水平明顯低于對(duì)照組。同時(shí)p62輕微下調(diào)，但LC3蛋白水平明顯下降，提示Nogo-B可能促進(jìn)了自噬體的成熟，而不是激活自噬。免疫熒光顯示細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)負(fù)荷時(shí)，LC3與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)存在共定位，表明自噬參與了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的降解。同時(shí)細(xì)胞中內(nèi)源性的Nogo-B和外源性的Nogo-B與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)均存在共定位，但是隨著細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的減少，Nogo-