銀杏內(nèi)酯B通過激活PXR保護(hù)細(xì)胞對抗外源性物質(zhì)的損害研究.pdf

1、本研究以銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B)為研究對象，以血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)為靶點(diǎn)，研究銀杏內(nèi)酯B是否能夠激活PXR并產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其相關(guān)分子機(jī)制。利用本實驗室建立的基于分泌型Gaussia熒光素酶報告基因pGLuc-Basic系統(tǒng)PXR-CYP3A4通路的藥物相互作用快速篩選平臺，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物中銀杏內(nèi)酯B對PXR具有潛在的激活作用。為進(jìn)一步驗證篩選結(jié)果，將

2、PXR調(diào)控的靶基因CYP3A4(cytochrome P4503A4，CYP3A4)作為指標(biāo)，考察銀杏內(nèi)酯B激活PXR后是否對CYP3A4產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。以內(nèi)源性PXR表達(dá)豐富的LS174T細(xì)胞作為研究細(xì)胞載體，通過siRNA/PXR干擾技術(shù)，實時定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測PXR被敲低前后，銀杏內(nèi)酯B對相關(guān)靶基因調(diào)控的變化差異，以確證篩選結(jié)果的可靠性，為進(jìn)一步藥理效應(yīng)和機(jī)制研究提供實驗數(shù)據(jù)支撐。在確認(rèn)銀杏內(nèi)酯B為PXR激

3、動劑后，進(jìn)一步對其激活PXR后血管內(nèi)皮保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)給予不同濃度的銀杏內(nèi)酯B和陽性藥利福平(Rifampicin，RIF)進(jìn)行處理。利用Realtime-PCR和Western Blot技術(shù)以及siRNA/PXR干擾技術(shù)，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡等檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活率，同時檢測PXR基因所調(diào)控的下游相關(guān)基因CY

4、P3A4和多藥耐藥基因(multidrug resistance1，MDR1)的mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)Caspase3/PreCaspase3蛋白比例、通過流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果和炎癥反應(yīng)相關(guān)的E-選擇素(E-selectin)和血管粘附反應(yīng)因子(vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1)在mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)水平的變化。并通過粘附實驗考察銀杏內(nèi)酯B激活PXR后對E-選擇素(

5、E-selectin)和血管粘附反應(yīng)因子(vascular cell adhesionmolecule1，VCAM-1)表達(dá)的改變對人急性白血病單核細(xì)胞株(THP-1)的黏附能力的影響。
　　結(jié)果顯示:1）銀杏內(nèi)酯B對LS174T細(xì)胞CYP3A4表達(dá)的影響，結(jié)果顯示銀杏內(nèi)酯B濃度依賴性上調(diào)CYP3A4基因及蛋白表達(dá)，提示銀杏內(nèi)酯B對CYP3A4確有誘導(dǎo)效應(yīng);在利用siRNA敲低PXR表達(dá)的條件下，銀杏內(nèi)酯B對CYP3A4誘導(dǎo)作用明

6、顯低于PXR未敲低組，進(jìn)一步表明PXR參與銀杏內(nèi)酯B對CYP3A4表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)，同時銀杏內(nèi)酯B對PXR表達(dá)無明顯影響。2）進(jìn)一步實驗顯示銀杏內(nèi)酯B對人臍靜脈細(xì)胞中CYP3A4和MDR1的mRNA表達(dá)同樣具有誘導(dǎo)作用，Western blot檢測結(jié)果顯示銀杏內(nèi)酯B對PXR蛋白的表達(dá)沒有明顯的誘導(dǎo)作用;PXR的核內(nèi)遷移實驗顯示銀杏內(nèi)酯B能明顯促進(jìn)PXR由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的遷移，細(xì)胞核內(nèi)PXR量隨著銀杏內(nèi)酯B濃度增加而增加。3）流式細(xì)胞檢測顯

7、示銀杏內(nèi)酯B有效降低ST引起的HUVECs細(xì)胞凋亡，當(dāng)PXR被敲低后，銀杏內(nèi)酯B抑制ST引起的HUVECs細(xì)胞凋亡作用被明顯削弱，提示銀杏內(nèi)酯B通過激活PXR受體能夠顯著地抑制細(xì)胞凋亡。4）銀杏內(nèi)酯B能顯著逆轉(zhuǎn)TNF-α所致E-selectin和VCAM-1上調(diào)和細(xì)胞粘附增加。PXR被敲低后這種逆轉(zhuǎn)效應(yīng)消失，提示銀杏內(nèi)酯B通過激活PXR受體降低炎癥相關(guān)分子表達(dá)，從而降低血管內(nèi)皮細(xì)胞病理狀態(tài)下炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用