應(yīng)用WT1抗原肽體外刺激培養(yǎng)DC-CIK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:以WT1基因陽(yáng)性的患者為研究對(duì)象，提取其外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，負(fù)載WT1復(fù)合抗原肽，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，檢測(cè)DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞的增殖能力、免疫表型變化，并檢測(cè)DC-CIK混合培養(yǎng)后對(duì)WT1基因陽(yáng)性K562細(xì)胞的殺傷作用，探索收獲WT1抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的合理途徑。
　　方法:DC細(xì)胞的培養(yǎng):抽取WT1陽(yáng)性白血病患者經(jīng)肝素抗凝后的外周血，經(jīng)肝素抗凝后，用淋巴細(xì)胞分離液分離

2、獲得單個(gè)核細(xì)胞(MNC，mononuclear cells)。然后用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/ml，孵育4小時(shí)后，提取貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml加入6孔培養(yǎng)板中，并加入細(xì)胞因子，使得重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)濃度為1000U/ml。第5天加入WTI混合抗原肽50ng/ml，實(shí)驗(yàn)組DC細(xì)胞負(fù)載WTI混合抗原肽，對(duì)照組

3、DC細(xì)胞不負(fù)載WT1抗原肽，第6天，兩組加重組人腫瘤壞死因子-a(rhTNF-a)，使?jié)舛葹?000U/ml，促進(jìn)DC細(xì)胞成熟。
　　CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng):同上來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)過(guò)單個(gè)核細(xì)胞的分離，孵育4小時(shí)后，收集懸浮的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，加入干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)1000U/ml，24小時(shí)后加入CD-3單抗(CD-3 monoclonal antibody)50ng/ml，重組人白細(xì)胞

4、介素-2(rh-interleukin-2，rhIL-2)500U/ml，以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，同時(shí)補(bǔ)充加入rhIL-2。培育第7天，用臺(tái)盼藍(lán)排斥法染色DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的RPMI1640液）調(diào)整DC細(xì)胞濃度為1×106/ml，CIK細(xì)胞濃度為5×106/ml，按照1∶5比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)，在共培養(yǎng)的第1天、第3天、第7天收集共培養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其免疫分子標(biāo)記，并檢測(cè)

5、其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。
　　結(jié)果:
　　1、負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞增殖能力的比較
　　在溫箱中孵育過(guò)的貼壁單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過(guò)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)后成樹(shù)突狀細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，培育中細(xì)胞外形發(fā)生變化，細(xì)胞量亦有增加。培育48小時(shí)后細(xì)胞體積較前增大，表面有毛刺樣突起，隨著培育時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞邊緣毛刺樣突起增多，變長(zhǎng)（見(jiàn)Fig.1）。
　　懸浮單

6、個(gè)核細(xì)胞在相應(yīng)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下擴(kuò)增成CIK細(xì)胞，并逐漸形成細(xì)胞團(tuán);CIK細(xì)胞最初，散在均勻分布，個(gè)小，亮而圓(見(jiàn)Fig.2)。在培養(yǎng)的第3天，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始呈現(xiàn)出不規(guī)則變化，并呈細(xì)胞團(tuán)樣生長(zhǎng)(見(jiàn)Fig.3)。從培養(yǎng)的第6天起，細(xì)胞明顯增殖，成叢或以集落狀態(tài)生長(zhǎng)，并懸浮于培養(yǎng)基中(見(jiàn)Fig.4)。隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，細(xì)胞集落數(shù)逐漸增多。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，第7天，負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)為（10.01±0.71

7、）倍，未負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK增生了(10.20±0.60)倍;第14天，負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞數(shù)為原來(lái)的(17.16±0.93)倍，未負(fù)載WT1抗原肽組是原來(lái)的(17.40±0.94)倍（見(jiàn)Table1）。分析比較同一組細(xì)胞的增殖倍數(shù)隨時(shí)間的增加均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以上結(jié)果說(shuō)明，是否負(fù)荷腫瘤抗原肽對(duì)DC-CIK的增殖沒(méi)有顯著影響。
　　2、負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組的DC-

8、CIK分子免疫表型的變化
　　分別收集培養(yǎng)第1天、7天及14天的兩組培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞分子免疫表型的變化。結(jié)果顯示:當(dāng)天測(cè)得白血病患者細(xì)胞的分子免疫表型結(jié)果如下:CD3+CD8+細(xì)胞為(30.34±3.14)％，CD3+CD56+細(xì)胞為（5.49±0.45）％。細(xì)胞培養(yǎng)的第7天、14天免疫表型檢測(cè)結(jié)果如下:負(fù)載WT1抗原肽組CD3+CD8+細(xì)胞為(40.25±2.66)％，(76.48±4.08)％，CD3+CD56

9、+細(xì)胞為(9.48±1.06)％，（29.11±4.27）％;未WT1負(fù)載抗原肽組CD3+CD8+細(xì)胞為(39.61±2.51)％，(75.61±6.27)％，CD3+CD56+細(xì)胞為（9.44±1.10）％，(29.11±4.91)％(見(jiàn)Table2)，在DC-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞，其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均有顯著提高，但兩

10、組無(wú)顯著性差異，即P＞0.05，以上數(shù)據(jù)說(shuō)明是否負(fù)荷抗原肽對(duì)誘導(dǎo)出的DC-CIK細(xì)胞的表型沒(méi)有影響。
　　3、負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞殺傷活性比較
　　采集培養(yǎng)14天的DC-CIK細(xì)胞做殺傷實(shí)驗(yàn)，收集培養(yǎng)的負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以WT1基因(+)的K562細(xì)胞和WT1基因(-)的HL60細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。負(fù)載WT

11、1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果為(49.21±4.78)％，(74.86±1.55)％，(83.01±2.35)％，同時(shí)檢測(cè)在相應(yīng)效靶比下，對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷為(39.18±1.96)％，(60.44±2.79)％，（69.56±1.45）％（見(jiàn)Table3），經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。
　　收集培養(yǎng)的未負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK細(xì)

12、胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以WT1基因(+)的K562細(xì)胞和WT1基因(-)的HL60細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。負(fù)載WT1抗原肽組DC-CIK在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時(shí)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性結(jié)果為(38.95±2.03)％，(59.48±3.97)％，(69.19±1.52)％，同時(shí)檢測(cè)在相應(yīng)效靶比下，對(duì)HL60細(xì)胞的殺傷為(39.95±1.45)％，(60.88±1.30)％，(70

13、.08±1.07)％(見(jiàn)Table4)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力無(wú)差異。
　　以上數(shù)據(jù)說(shuō)明負(fù)載WT1抗原肽組和未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞對(duì)WT1基因(-)的HL60細(xì)胞均有殺傷作用，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組對(duì)WT1(+)的K562細(xì)胞的殺傷，負(fù)載WT1抗原肽組明顯強(qiáng)于未負(fù)載WT1抗原肽組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源的DC-CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。
　　結(jié)論:

14、r>　　1、應(yīng)用白血病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)負(fù)荷抗原的的培養(yǎng)方法可培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞，且具有殺傷活性。
　　2、負(fù)載WT1抗原肽組與未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞，其CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均有顯著提高，兩組無(wú)顯著性差異。
　　3、負(fù)載WT1抗原肽組和未負(fù)載WT1抗原肽組來(lái)源DC-CIK細(xì)胞對(duì)WT1基因(-)的HL60細(xì)胞均有殺傷作用，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、兩組對(duì)WT1