WT1多肽致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTLs殺傷白血病細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人體免疫監(jiān)視功能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，腫瘤具有多種逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的機(jī)制，目前認(rèn)為，重要的是抗原遞呈功能不足，以致產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞很難識別和殺滅腫瘤細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)，被認(rèn)為是體內(nèi)唯一能活化靜息T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，是特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)過程。以DC為中心的免疫治療成為腫瘤生物免疫學(xué)治療熱點(diǎn)之一。隨著化療及造血干細(xì)胞移植技術(shù)的改進(jìn)，白血病治療的緩解率明顯提高，但

2、仍有較多患者因復(fù)發(fā)而死亡。一般認(rèn)為復(fù)發(fā)的根源主要原因是機(jī)體白血病微小殘留病(MRD)。清除MRD依耐效應(yīng)T細(xì)胞對白血病抗原的識別及高效的抗原遞呈。白血病患者化療后機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，白血病細(xì)胞雖表達(dá)MHC分子但其水平降低，缺乏協(xié)同刺激分子及粘附分子，白血病細(xì)胞抗原的免疫原性下降，抗原遞呈作用弱，且白血病患者體內(nèi)DC的成熟受阻，抗原遞呈等功能受損，不能有效啟動(dòng)針對白血病有效的免疫應(yīng)答。近年來研究證實(shí)各種形式的腫瘤抗原致敏DC后可以在體內(nèi)

3、外誘導(dǎo)出腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)，發(fā)揮最大限度特異性抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)而清除腫瘤病灶，使防止復(fù)發(fā)成為可能。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞是一種新型、高效的具有廣譜殺瘤活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有極強(qiáng)的增殖能力。1900年Call等從Wilms瘤細(xì)胞中分離出Wilms腫瘤基因(WT1)，其基因定位于染色體11P13。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人類各種白血病中有WT1基因異常表達(dá)或缺陷，與白血病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有很大關(guān)系。WT1多肽是已經(jīng)

4、鑒定出的白血病多肽，GaoL等用WT1多肽致敏T淋巴細(xì)胞后能選擇性清除慢性粒細(xì)胞白血病CD34+祖細(xì)胞。WT1多肽是一個(gè)可用于誘導(dǎo)特異性CTLs的腫瘤相關(guān)抗原。CD40L是人類DC成熟重要刺激信號，sCD40L在體外不僅具有顯著的誘導(dǎo)DC分化，促進(jìn)DC成熟的功能，而且經(jīng)sCD40L作用的DC能更有效地激發(fā)T細(xì)胞。本研究組前期實(shí)驗(yàn)研究中聯(lián)合應(yīng)用GM-SCF、IL-4和TNF-α培養(yǎng)出DC[1，2]，并用WT1多肽負(fù)載DC誘導(dǎo)CTLs，對K

5、562細(xì)胞顯示高殺傷率。 研究目的 1.聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫表型、混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)等方面對DC進(jìn)行鑒定，觀察CD40L對DC免疫功能的影響。 2.研究DC分別負(fù)載WT1多肽抗原及不同白血病細(xì)胞凍融抗原(K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞)，與經(jīng)IL-2、INF-γ等誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞共培

6、養(yǎng)，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，觀察CTLs對白血病細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)，比較WT1多肽與凍融抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)CTLs殺傷白血病細(xì)胞的差異。 結(jié)論 1.通過聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)活化出DC，倒置顯微鏡觀察具有典型樹突狀形態(tài)特征；流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)高水平的共刺激分子；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示其具有極強(qiáng)的刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的

7、能力。表明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)得到的DC具有極強(qiáng)的免疫原性。 2.通過聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhIL-2、rhINF-γ等誘導(dǎo)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，并與DC共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD8+、CD3+CD28+、CD3+CD8+CD28+及CD3+CD56+細(xì)胞群有所增加。 3.聯(lián)合應(yīng)用CD40L能上調(diào)DC免疫刺激分子表達(dá)，提高DC免疫原性，增強(qiáng)活化CTLs能力。 4.分別用WT1多肽抗原及K562、HL60和Jurk

8、at細(xì)胞凍融抗原沖擊致敏DC，WT1多肽抗原及凍融抗原在不同效靶比下，致敏DC所激發(fā)的CTLs在不同效靶比下對K562、HL60或Jurkat細(xì)胞的殺傷率均高于單純DC組和單核細(xì)胞對照組(P＜0.01)，且在每一組中，它們所激發(fā)的CTLs殺傷活性均隨著效靶比的提高而相應(yīng)提高，顯示了殺傷活性的量效關(guān)系。 5.WT1多肽抗原與凍融抗原致敏DC組間兩兩比較(P＞0.05)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見WT1多肽抗原與K562、HL60或Jur