趨化因子配體6促進肝細胞增殖并抑制肝星狀細胞分泌I型膠原的分子機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　逆轉肝纖維化是目前研究的熱點，有效促進肝細胞再生是實現(xiàn)肝纖維化逆轉的必備條件。肝細胞增殖及Ⅰ型膠原降解是實現(xiàn)肝細胞再生的關鍵環(huán)節(jié)，研究表明，CXCR1表達缺失抑制肝細胞再生，CXCL6作為CXCR1的主要配體，在肝細胞再生中的作用值得探討。在本研究中我們將探討趨化因子配體6（CXCL6）對肝細胞增殖和肝星狀細胞合成及分泌I型膠原的影響，以期闡明CXCL6促進肝細胞再生的分子機制。
　　方法：
　　1.

2、建立動物模型：采用40%四氯化碳皮下注射的方法構建大鼠肝纖維化模型，其中模型組32只，對照組12只。分別于開始實驗后的第2、4、6和8周末處死8只模型組大鼠及3只對照組大鼠。留取肝臟組織進行HE和Masson染色觀察大鼠肝臟病理學變化；ELISA法檢測各組大鼠血清中CXCL6、IL8、TNF-α、MCP-1、COLI和COLIII水平變化；Real-time PCR和Western blot法檢測大鼠肝臟組織中CXCL6及其受體mRNA

3、和蛋白水平的表達變化；免疫組織化學染色法觀察CXCL6在大鼠肝臟內的表達位點。
　　2.細胞免疫熒光法檢測大鼠BRL肝細胞株及HSC-T6細胞株中CXCL6、CXCR1和CXCR2的表達。
　　3.化學合成CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA，Real-time PCR法檢測其轉染效率。
　　4.細胞分組：BRL細胞株和HSC-T6細胞株可被分為：①陰性對照組；②CXCL6（100ng/ml）干預組；③CXC

4、R1-siRNA干預組；④CXCR2-siRNA干預組；⑤CXCL6（100ng/ml）+CXCR1-siRNA干預組；⑥CXCL6（100ng/ml）+CXCR2-siRNA干預組。
　　5. MTT法檢測CXCL6、CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對大鼠BRL細胞株和HSC-T6細胞株增殖能力的影響。
　　6.ELISA法檢測HSC-T6細胞各干預組上清液中I型膠原的含量。
　　7.Western b

5、lot法檢測BRL細胞株各干預組中PCNA、NF-κB、STAT3和p-STAT3的表達變化；檢測HSC-T6細胞株各干預組中I型膠原的表達變化。
　　8.病例收集：收集50例慢性乙型肝炎患者的血清標本及臨床資料，并根據Scheuer分期將其分為S0-S4期肝纖維化，每組各10例。留取血清標本采用ELISA法檢測CXCL6的表達變化。
　　結果：
　　1.基于四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型的實驗表明：①成功構建四氯化碳誘

6、導的大鼠肝纖維化模型，2周末模型組匯管區(qū)未見明顯炎性細胞浸潤及纖維沉積；4周末模型組匯管區(qū)可見的大量炎性細胞浸潤及少量纖維沉積；6周末匯管區(qū)炎性細胞浸潤加重及膽管增生，大量纖維沉積但未形成假小葉；8周末時可見部分肝細胞壞死，假小葉形成；②Real-time PCR及Western blot結果表明，肝組織內CXCL6及其受體mRNA和蛋白水平隨纖維化程度加重而逐步提高；③ELISA結果顯示，大鼠血清中CXCL6的水平同樣隨肝纖維化程度加

7、重而上調；④免疫組織化學染色法表明，CXCL6在正常對照組大鼠的肝臟中可表達與肝臟腺泡3帶，隨著肝纖維化進展CXCL6不僅在肝臟內表達增多，還可表達與匯管區(qū)的間質細胞內。⑤相關性分析顯示，自造模2W起CXCL6水平即與IL8及TNF-α水平密切相關；自造模6W起，CXCL6水平與COLI水平相關；造模8周時CXCL6與COLIII呈現(xiàn)相關性；CXCL6與MCP-1在造模2周時及8周時呈現(xiàn)相關性。
　　2.基于大鼠BRL肝細胞株的實

8、驗表明：①激光共聚焦結果顯示，CXCL6可表達與BRL細胞的胞質，CXCR1和CXCR2則均表達與細胞的胞核；②MTT結果表明，CXCL6（10-1000ng/ml）在不同時間點（12、24、48及72小時）均可刺激BRL細胞增殖；CXCR1-siRNA可抑制BRL細胞增殖；CXCR2-siRNA對BRL細胞的增殖能力無明顯影響；CXCR1-siRNA干擾BRL細胞后，CXCL6無法促進BRL細胞增殖。③Western blot結果顯示

9、，CXCL6可上調BRL細胞中PCNA和NF-κB的蛋白水平，但對p-STAT3的蛋白水平無明顯影響；此外，CXCR1-siRNA可顯著下調BRL細胞中NF-κB、STAT3和p-STAT3的水平；CXCR2-siRNA僅可顯著下調BRL細胞中p-STAT3的水平。
　　3.基于大鼠HSC-T6細胞株的實驗表明：①激光共聚焦結果顯示：CXCL6和CXCR1可表達與HSC-T6細胞的胞質中，CXCR2則可表達與細胞的胞核中；②MTT

10、結果顯示，CXCL6、CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對HSC-T6的增殖能力均無明顯影響；③ELISA結果顯示：CXCL6（100ng/ml）可顯著降低HSC-T6細胞上清液中I型膠原的含量；而CXCR1-siRNA和CXCR2-siRNA對細胞上清液中I型膠原的含量無明顯影響；④Western blot結果顯示，與ELISA結果一致，CXCL6可降低HSC-T6細胞內I型膠原的含量，CXCR1-siRNA和CXCR2-

11、siRNA對細胞內I型膠原的含量無明顯影響。
　　4.基于慢性乙型肝炎患者的研究表明：①ELISA結果顯示，CXCL6水平隨患者纖維化分期及炎癥分級的增高而上調；②慢性乙型肝炎患者血清中CXCL6水平在輕度纖維化與顯著纖維化患者之間存在顯著差異；③相關性分析表明，肝纖維化進程中CXCL6水平與ALT、AST以及白蛋白的水平呈正性相關關系。
　　結論：
　　肝纖維化進程中含量隨疾病嚴重程度逐漸上調的CXCL6可通過CXC