靶向癌胚抗原的嵌合受體的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　過繼細(xì)胞治療(adoptive cell therapy，ACT)是指自體免疫細(xì)胞進(jìn)行體外大量擴(kuò)增，然后將其回輸至腫瘤患者體內(nèi)。因其副作用小，安全性高，可去除腫瘤患者體內(nèi)微小殘留灶等優(yōu)點(diǎn)。目前臨床上廣泛使用的是非特異性的過繼細(xì)胞治療，如淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(lymphokine activated killer cell，LAK)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltratinglymphocytes，TILs

2、)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell，CIK)等。由于這些細(xì)胞并非經(jīng)過腫瘤特異性篩選，其TCR識(shí)別腫瘤抗原具有隨機(jī)性，且腫瘤細(xì)胞通常下調(diào)MHC分子，從而抑制T細(xì)胞對腫瘤抗原識(shí)別和殺傷。
　　嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CARs)由抗原識(shí)別域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)域依次連接組成，抗原識(shí)別域即scFv(single chain variable

3、 fragment)，由腫瘤特異性單克隆抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)結(jié)構(gòu)域連接構(gòu)成;胞內(nèi)信號(hào)域通常為CD3ζ鏈或FcRγ，或與一種或多種共刺激分子相連，如OX-40/CD134，CD137/4-1BB，CD28等。腫瘤細(xì)胞表面的抗原（配體）與嵌合抗原受體的抗體（受體）結(jié)合時(shí)，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，胞內(nèi)信號(hào)域?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為活化信號(hào)，激活效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞增殖、產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶等從而殺

4、傷腫瘤細(xì)胞。其具有以下優(yōu)勢:特異性:①抗體（受體）特異性識(shí)別抗原（配體）;②MHC非限制性:不需要與MHC-Ⅰ分子結(jié)合，并且可克服腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)腫瘤抗原及腫瘤微環(huán)境下調(diào)MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸;③不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因TCR與患者內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配的情況;④抗原來源廣，可以是糖類、脂類、蛋白質(zhì)。
　　癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一種糖蛋白，在60-94％轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌中高表達(dá)，廣

5、泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌臨床輔助診斷、預(yù)后及復(fù)發(fā)監(jiān)測指標(biāo)。因此在已有研究基礎(chǔ)上本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了以抗CEA單鏈抗體為嵌合抗原受體的慢病毒載體LV-EF1α-scFv(CEA)-CD3-2A-GFP-WPRE，其胞內(nèi)信號(hào)為CD3ζ鏈。通過慢病毒包裝，感染人T細(xì)胞，探討該嵌合抗原受體在T細(xì)胞中的表達(dá)情況及對結(jié)直腸癌CEA陽性腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用。為后續(xù)研究及應(yīng)用嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療結(jié)直腸癌奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.

6、分子克隆技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體LV-EF1α-scFv(CEA)-2A-GFP-WPRE。
　　2.磷酸鈣法包裝慢病毒。
　　3.慢病毒感染人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)細(xì)胞。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)和非變性非還原Western blot檢測scFv(CEA)-CAR在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。
　　5.體外實(shí)驗(yàn)檢測CAR修飾T細(xì)胞對結(jié)直腸癌CEA陽性腫瘤細(xì)

7、胞系，CEA陰性腫瘤細(xì)胞殺傷作用。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切、連接等常規(guī)分子克隆技術(shù)及核苷酸序列檢測，證實(shí)成功構(gòu)建慢病毒載體LV-EF1α-scFv(CEA)-2A-GFP-WPRE。
　　2.磷酸鈣法包裝慢病毒，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測得病毒滴度為3×107TU/ml。
　　3.以10MOI慢病毒感染外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過14天的培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察到感染后T細(xì)胞呈典型聚集生長型態(tài)，且細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，

8、表明慢病毒成功感染T細(xì)胞。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測scFv(CEA)-CAR在感染后T細(xì)胞的表達(dá)率為62.8％，非變性非還原Western blot證實(shí)感染后的T細(xì)胞可正確表達(dá)抗CEA抗體。
　　5.CAR修飾T細(xì)胞對結(jié)直腸癌CEA陽性腫瘤細(xì)胞系有特異性的殺傷作用，CEA陰性的腫瘤細(xì)胞系幾乎無殺傷作用。
　　結(jié)論：
　　嵌合抗原受體可在T細(xì)胞中正確表達(dá)，對結(jié)直腸癌CEA陽性腫瘤細(xì)胞系有特異性殺傷作用。為后續(xù)體內(nèi)研