嵌合降鈣素基因的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、降鈣素(Calcitonin，CT)是由哺乳動(dòng)物的甲狀腺C細(xì)胞或魚類的后腮體分泌的多肽類激素，由32個(gè)氨基酸殘基組成，主要參與體內(nèi)的鈣、磷代謝。天然降鈣素中，鮭魚降鈣素(sCT)的活性最高，而人降鈣素(hCT)的活性相對(duì)較低。化學(xué)合成sCT用于臨床多年，是治療骨質(zhì)疏松、Paget's病、高鈣血癥和變形性骨炎等的有效藥物。 為改進(jìn)重組降鈣素的抗原性和活性，我們以人和鮭魚降鈣素為先導(dǎo)，利用化學(xué)合成和酶法合成了長111bp的嵌合降鈣素

2、(hsCT)基因，該基因編碼34個(gè)氨基酸的多肽，其中包括14個(gè)人源氨基酸，16個(gè)鮭魚源氨基酸。蛋白質(zhì)軟件分析預(yù)測(cè)，其活性高于hCT，而抗原性較sCT降低。 首先利用融合表達(dá)載體pGEX，獲得了含GST的融合蛋白(GST-hsCT)，并證明具有人降鈣素的抗原決定簇部分；但在純化目的蛋白時(shí)，無法實(shí)現(xiàn)高效率切割。隨后，我們利用串聯(lián)多拷貝策略，以單分子和多聚體兩種形式表達(dá)了系列降鈣素，但表達(dá)量仍然偏低。 選用安全無毒的藻藍(lán)蛋白的

3、β亞基基因通過一柔性手背與嵌合CT基因融合，構(gòu)建融合蛋白cpcB-hsC基因，首先在大腸桿菌，先后選用pGEX和pLEX兩個(gè)系統(tǒng)對(duì)該融合基因進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白的抗原性及活性進(jìn)行了測(cè)定。同時(shí)，還探討了融合串聯(lián)形式存在的蛋白表達(dá)。 在對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行抗原性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，本研究最初設(shè)計(jì)并合成的基因所表達(dá)的降鈣素雖然具有人降鈣素的抗原決定簇部分，但與抗鮭魚降鈣素抗血清仍然具有交叉反應(yīng)，為探索嵌合降鈣素的抗原位點(diǎn)與活性位點(diǎn)，本研