應用SILAC技術研究藍萼甲素誘導A549細胞凋亡的分子機制.pdf

1、背景：以往研究表明藍萼甲素能夠抑制多種腫瘤細胞增殖，并可誘導細胞凋亡。然而有關藍萼甲素誘導腫瘤細胞凋亡的詳細分子機制至今仍未闡釋清楚。
　　目的：應用穩(wěn)定同位素標記氨基酸細胞培養(yǎng)（stable isotope labeling by amino acid in cell culture，SILAC）定量蛋白質組學方法，探討藍萼甲素（Glaucocalyxin A）誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的分子機制。
　　方法：藍萼甲素作

2、用于A549細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化情況，蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡標志蛋白---多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]剪切條帶（Cleaved PARP）的表達變化；應用SILAC定量蛋白質組學技術分析藍萼甲素誘導A549細胞凋亡后細胞內蛋白質表達水平的變化，蛋白免疫印跡法驗證差異蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTO

3、R）的表達情況；蛋白免疫印跡法檢測細胞自噬標志蛋白---微管相關蛋白1輕鏈3 II型蛋白（microtubule associated protein1 light chain3 II，LC3-II），藍萼甲素聯(lián)合應用3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）作用于A549細胞后，細胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測細胞的存活率和蛋白免疫印跡法檢測Cleaved PARP表達變化情況。
　　結果：藍萼甲素作用于人肺腺癌A5

4、49細胞后，流式細胞儀檢測結果顯示，細胞凋亡率從5％增加到18%；蛋白免疫印跡結果表明，Cleaved PARP蛋白表達量明顯上調。定量蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)藍萼甲素誘導細胞凋亡后有75個蛋白質表達水平上調，同時有59個蛋白質表達水平下調；我們從這134個差異表達蛋白中選擇了mTOR蛋白進行表達水平驗證，蛋白免疫印跡結果表示：藍萼甲素細胞組mTOR蛋白表達水平明顯下調，這與定量蛋白質組學分析結果是一致的；藍萼甲素細胞組LC3-II蛋白表達顯

5、著上調；聯(lián)合應用藍萼甲素和自噬抑制劑3-MA后，結果表明，細胞存活率進一步下降，且Cleaved PARP表達水平進一步增加。
　　結論：鑒定了134個蛋白在藍萼甲素誘導人肺腺癌A549細胞凋亡過程中表達水平發(fā)生了顯著變化，并采用蛋白免疫印跡法證實了mTOR蛋白的表達水平顯著下調，該結果與定量蛋白質組學檢測數(shù)據(jù)是一致的；并據(jù)此線索通過實驗研究發(fā)現(xiàn)藍萼甲素誘導A549細胞凋亡的同時可激活自噬，這種自噬激活作用對細胞存活起著保護作用。