極長鏈脂肪酸與2型糖尿病大鼠腦Aβ生成的關系研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性神經系統退行性疾病，以進行性記憶和認知功能減退為主要臨床表現。AD的特征性病理改變?yōu)棣?淀粉樣蛋白(amyloid protein，Aβ)在神經細胞外沉積形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不僅是老年人常見的疾病，也是糖尿病(diabetes mellitus，DM)病人高發(fā)的疾病。這對糖尿病病人無疑是雪上添霜。因此，亟待弄清糖尿病病人高發(fā)AD的原因，找到

2、干預措施。
　　基于以下兩個事實:(1)報道顯示，AD病人腦中極長鏈脂肪酸(verylong chain fatty acids，VLCFA.，≥C22)水平增加。VLCFA對神經細胞具有脂毒性，可以導致細胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生增多，氧化應激增強。而氧化應激是目前公認的Aβ生成增多的重要機制之一。(2)糖尿病是糖脂代謝紊亂疾病。我們假設，在糖尿病狀態(tài)下，脂代謝的紊亂會使腦中的VLC

3、FA聚集，進而引起氧化應激，使Aβ異常生成增加，最終導致認知障礙，糖尿病AD發(fā)生。
　　為了證實此假設，本實驗用高脂飲食加小劑量STZ的方法誘導2型糖尿病的大鼠模型，觀察2型糖尿病大鼠的學習記憶情況，以及腦中Aβ的生成、氧化應激水平和VLCFA的變化，探討VLCFA在2型糖尿病大鼠腦Aβ生成中的作用，為預防及治療糖尿病AD提供新的實驗依據。
　　方法:
　　1實驗動物
　　以本實驗室侯連國等人制備的2型糖尿病大鼠

4、的腦組織為實驗材料。實驗動物分為對照組(Con)和2型糖尿病組(DM)。
　　2 Morris水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力
　　用上海吉量軟件科技有限公司Morris水迷宮，采用定位航行試驗和空間探索試驗，分別記錄大鼠的平均逃避潛伏期、穿越原平臺位置的次數和第一次到達原平臺的時間，以評估大鼠的學習記憶能力。
　　3 ELISA檢測腦組織Aβ40、BACE1的含量
　　用日本IBL公司ELISA試劑盒進行測定，腦A

5、β40的含量以pg/mgprotein表示;腦BACE1的含量以ng/μgprotein表示。
　　4實時定量PCR檢測腦APP和BACE1的mRNA表達
　　用美國OMEGA公司總RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。以18S rRNA做內參，實時定量PCR測定APP、BACE1 mRNA的相對表達量。
　　5免疫組織化學分析腦組織APP的蛋白水平
　　對大鼠腦組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，分析APP的蛋

6、白表達水平。
　　6氣相色譜分析腦組織VLCFA
　　提取各組大鼠腦組織脂肪酸，用日本島津公司氣相色譜儀(GC-2010Plus)分析每種VLCFA的含量。
　　7 TBA法測定腦組織丙二醛(MDA)含量
　　采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法進行測定，腦MDA的含量以nmol/mgprot表示。
　　8 Western blot檢測NOX4，p47和HO-1的蛋白表達
　　提取大鼠腦組織總蛋白，Wes

7、tern blot測定NOX4，p47和HO-1蛋白的相對表達量。
　　9數據處理
　　實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，對測定結果進行正態(tài)性與方差齊性檢驗，數據用x±SD表示。逃避潛伏期數據采用重復測量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)進行統計，其它數據采用Student'st檢驗分析兩組之間均數的統計學差異。以P＜0.05表示差異有統計學意義。
　　結果:

8、r>　　1 DM大鼠的學習記憶能力下降
　　與Con組相比，雖然DM組大鼠第一天的逃避潛伏期有所延長，但隨后幾天均沒有明顯差異。DM組大鼠，與Con組相比，穿越原平臺次數明顯減少，第一次到達原平臺時間明顯延長，差異有統計學意義(P＜0.01)。表明，2型糖尿病大鼠的學習記憶能力下降。
　　2 DM大鼠腦中Aβ生成增加
　　2.1腦組織Aβ的含量
　　ELISA結果顯示，Con組和DM組大鼠腦組織Aβ40含量分別為

9、:Con(4.87±0.71 pg/mg protein)，DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM組腦組織Aβ含量較Con組明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.01)。表明，糖尿病大鼠腦Aβ水平增加。
　　2.2腦組織APP的表達
　　實時定量PCR結果顯示，DM組腦組織APP mRNA的表達水平(0.046±0.014)較Con組(0.025±0.007)明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.001)。

10、
　　免疫組化結果顯示，DM組腦組織中APP陽性細胞數量、著色深度較Con組明顯增加;圖像分析顯示，DM組大鼠腦中APP陽性細胞的平均光密度值較Con組顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.001)。
　　表明，糖尿病大鼠腦APP的mRNA和蛋白表達均增加。
　　2.3腦組織BACE1的表達
　　實時定量PCR結果顯示，DM組腦組織BACE1 mRNA的表達水平(0.912±0.038)較Con組(0.661±0.

11、118)明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.001)。
　　ELISA結果顯示，DM組腦組織BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μgprotein)較Con組(0.78±0.06 ng/μg protein)明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.01)。
　　表明，糖尿病大鼠腦BACE1的mRNA和蛋白表達均增加。
　　以上結果表明，糖尿病大鼠腦中APP的β-分泌酶裂解途徑上調，從而導致Aβ生成增加，出現類似AD

12、的病理改變。
　　3 DM大鼠腦中C26∶0水平增加
　　氣相色譜結果顯示，DM組C26∶0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)較Con組(18.38±6.29μmol/g tissue)顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.001); C22∶0、C24∶0含量在DM組與Con組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。表明，糖尿病大鼠腦極長鏈脂肪酸C26∶0水平增加。
　　4 DM大鼠腦中C26∶0水

13、平與Aβ含量呈正相關
　　相關分析結果顯示，腦組織C26∶0水平與Aβ含量呈正相關(r=0.557，P=0.016)。表明，糖尿病大鼠腦C26∶0水平增加與Aβ生成增加有關。5 DM大鼠腦氧化應激增強
　　TBA結果顯示，DM組腦組織MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mgprotein)較Con組(1.83±0.19 nmol/mg protein)明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　Weste

14、rn blot結果顯示，DM組大鼠腦組織氧化應激指標NOX4，p47和HO-1的蛋白表達水平均高于Con組。
　　表明，糖尿病大鼠腦氧化應激水平增強。
　　6 DM大鼠腦中C26∶0水平與MDA含量呈正相關
　　相關分析結果顯示，腦組織C26∶0水平與MDA含量呈正相關(r=0.504，P=0.033)。表明，糖尿病大鼠腦C26∶0水平增加與氧化應激水平增強有關。
　　結論:
　　12型糖尿病大鼠的認知功能