心律失常的發(fā)生機制及干預(yù)研究.pdf

1、第一部分 TRDN和CALM1的多態(tài)性位點與慢性心力衰竭患者心源性猝死的相關(guān)性研究
　　背景:
　　慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)因其較高的發(fā)病率、較差的預(yù)后和逐年增加的社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)等已成為當(dāng)今世界的公共健康難題。盡管近年來醫(yī)學(xué)界已在CHF的研究和治療方面取得了很大進(jìn)展，但其發(fā)病率和病死率仍然居高不下:國外報道患者五年死亡率約為50％，但我國尚缺乏CHF患者治療現(xiàn)狀及長期預(yù)后的前瞻性研究，

2、未能對我國CHF患者進(jìn)行綜合評估。在CHF的死亡患者中，約半數(shù)死于惡性室性心律失常事件，即心源性猝死（Sudden cardiac death，SCD）。因此，對SCD進(jìn)行預(yù)防和預(yù)警成為改善CHF預(yù)后的重要措施。研究發(fā)現(xiàn)有多種因素可提示CHF患者具有發(fā)生SCD的風(fēng)險（包括心電學(xué)指標(biāo)、血流動力學(xué)狀態(tài)、生物學(xué)標(biāo)記物和炎癥因子等），但敏感性和穩(wěn)定性欠佳，限制了其在臨床的應(yīng)用。目前認(rèn)為，在普通人群中SCD是一種可以遺傳的性狀。SCD的發(fā)生大多是

3、由于發(fā)生了致命性的心律失常，而鈣離子循環(huán)在惡性心率失常的發(fā)生中起著十分重要的作用。不僅如此，近年來，有兩項研究均發(fā)現(xiàn)了調(diào)控鈣離子蛋白的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP, Single nucleotide polymorphism)與SCD具有相關(guān)性。其中一項對心衰人群的研究發(fā)現(xiàn)鈣離子釋放通道的兩個SNP位點(rs3766871和rs790896)與SCD的發(fā)生相關(guān);另外一項研究則發(fā)現(xiàn)CASQ2的三個SNP位點（rs17500488、 rs3

4、010396和rs7366407）與SCD相關(guān)。
　　目的:
　　本研究為大樣本的前瞻性研究，目的在于發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)控蛋白上具有潛在功能的基因變異與SCD的相關(guān)性，探索鈣調(diào)控蛋白的SNP位點與CHF患者預(yù)后的關(guān)系，從而確定CHF患者中致SCD的遺傳學(xué)標(biāo)記物。
　　材料與方法:
　　入選對象為:從2005年至2009年1月就診于阜外心血管病醫(yī)院的慢性心力衰竭患者。入選標(biāo)準(zhǔn)包括:由于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病導(dǎo)致的慢性心力衰

5、竭，左心室射血分?jǐn)?shù)≤50％;由于擴張性心肌病導(dǎo)致的慢性心力衰竭，左心室射血分?jǐn)?shù)≤45％;紐約心功能分級為Ⅱ-Ⅳ級。門診和電話隨訪慢性心力衰竭患者的死亡和猝死終點。采用候選基因策略分析20個多態(tài)性位點與心源性猝死的關(guān)系，采用質(zhì)譜的方法進(jìn)行基因分型，采用多元線性回歸、Cox風(fēng)險比例模型分析基因型對生存狀況的影響，最后采用log-rank檢驗分析基因型與終點事件的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果:
　　最終入選了1429個慢性心力衰竭病人，研究了

6、十個鈣離子調(diào)控蛋白基因的20個多態(tài)性位點與心源性猝死以及全因死亡的關(guān)系。我們的中位隨訪時間為63個月，其中538個(37.65％)病人死亡，這些人中有185個人死于心源性猝死，其他為非心源性猝死。P值小于0.0025認(rèn)為顯著相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CALM1上的多態(tài)性位點rs3814843的CC基因型會顯著增加心源性猝死的風(fēng)險(HR5.542，95％CI2.054-14.948，P=.001)以及全因死亡的風(fēng)險(HR3.484，95％ CI1.6

7、51-7.350，P=.001)。調(diào)整了猝死相關(guān)的危險因素后，rs3814843仍與心源性猝死以及全因死亡顯著相關(guān)，不僅如此，TRDN基因多態(tài)性位點rs361508的G等位基因也會顯著增加慢性心力衰竭患者心源性猝死的風(fēng)險。
　　結(jié)論:
　　CALM1的多態(tài)性位點rs3814843與SCD的發(fā)生密切相關(guān)，此位點還與全因死亡相關(guān)。不僅如此，TRDN上的多態(tài)性位點亦rs361508與慢性心力衰竭患者SCD的發(fā)生顯著相關(guān)，我們的工作

8、為全面了解心源性猝死的發(fā)生機制提供了新的參考。
　　第二部分 LMNA基因的錯義突變(445 V＞E)與心肌致密化不全的相關(guān)性研究
　　背景:
　　心肌致密化不全(LVNC，Left Ventricular Noncompaction)以心內(nèi)膜海綿狀結(jié)構(gòu)形成為特點，這一海綿狀結(jié)構(gòu)是由心肌纖維交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所形成，與正常致密的心室肌有區(qū)別顯著。盡管心肌致密化不全發(fā)生的原因尚未明確，目前認(rèn)為家族性心肌致密化不全的發(fā)生與基因

9、突變有關(guān)。前期的研究發(fā)現(xiàn)多個基因(MYH7，ACTC，TNNT2，MYBPC3，LMNA，TAZ，DTNA，SNTA1等)的多個突變位點與心肌致密化不全的發(fā)生有關(guān)，其中包括核纖層蛋白的兩個突變位點。
　　核纖層蛋白基因(LMNA)位于1號染色體長臂，通過選擇性剪接，LMNA編碼兩個蛋白:A型核纖層蛋白和C型核纖層蛋白（lamin A/C）。這兩個蛋白僅在羧基端存在的差異，二者均是Ⅴ型中間絲蛋白，其結(jié)構(gòu)包括氨基端的頭部、α螺旋形成的

10、桿狀結(jié)構(gòu)和一個位于羧基端的長尾巴結(jié)構(gòu)，這個尾巴結(jié)構(gòu)包括一個保守的球狀結(jié)構(gòu)域形成的免疫球蛋白（Ig，Immunoglobulin）樣折疊。這一Ig樣折疊包括九個β片層，這些β片層形成經(jīng)典的β三明治結(jié)構(gòu)。Ig樣折疊有多種配體，包括DNA和細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，如片層連接蛋白2和emerin。A型和C型核纖層蛋白均是細(xì)胞核的組分，并參與形成細(xì)胞核內(nèi)膜和核纖層，核纖層蛋白與細(xì)胞核的穩(wěn)定作用是核膜力學(xué)完整性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　核纖層蛋白基因突變還與

11、多種疾病表型有關(guān)，這些疾病包括:E-D氏肌營養(yǎng)不良(EDMD)、肢帶肌營養(yǎng)不良癥（LGMD）、擴張性心肌病和家族型部分脂肪代謝障礙(FPLD)。前期的研究結(jié)果也表明核纖層蛋白的突變會導(dǎo)致惡性心律失常及心源性猝死的發(fā)生。盡管植入式除顫器(ICD，implantable cardioverterdefibrillator)的預(yù)防性應(yīng)用可以挽救病人的生命，但是核纖層蛋白的突變與致命性心律失常的發(fā)生之間的關(guān)系目前尚未明確。
　　目的:

12、r>　　在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)了一個心肌致密化不全的家系，先證者多次發(fā)生室速及室顫，并有家族猝死史，并發(fā)現(xiàn)其核纖層蛋白第445位氨基酸存在一個錯義突變，為了深入研究此突變所導(dǎo)致的功能及結(jié)構(gòu)影響，并揭示此突變位點與猝死之間的關(guān)系，我們進(jìn)行了本研究。
　　方法:
　　從病人外周血白細(xì)胞中提取其基因組DNA，并通過一代測序的方法對其DNA進(jìn)行檢測，以發(fā)現(xiàn)基因突變位點。隨后將突變及野生型基因連接到載體上，野生型或突變型核纖層蛋白的質(zhì)

13、粒與鈉通道(SCN5A)質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實驗，并用熒光顯微鏡觀察核纖層蛋白在細(xì)胞的分布。最后通過結(jié)構(gòu)建模模擬突變位點對核纖層蛋白結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果:
　　通過測序分析發(fā)現(xiàn)先證者及其父親的核纖層蛋白第445位氨基酸殘基上均存在一個錯義突變，這一突變位點位于核纖層蛋白的免疫球蛋白樣折疊的β2折疊上，導(dǎo)致第445位的中性疏水性氨基酸纈氨酸變?yōu)樗嵝杂H水性氨基酸亮氨酸。載體構(gòu)建成功后，將野生型鈉通道

14、分別與野生型及突變型核纖層蛋白共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過全細(xì)胞膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn):共轉(zhuǎn)染突變型核纖層蛋白的鈉通道，其峰值電流較共轉(zhuǎn)染野生型核纖層蛋白時顯著降低，同時，鈉通道的激活曲線、失活曲線及失活后恢復(fù)曲線均未發(fā)生明顯變化。通過熒光顯微鏡，我們發(fā)現(xiàn)突變的核纖層蛋白不再像野生型核纖層蛋白那樣均勻分布于細(xì)胞核表面，而是聚集成團塊狀，形成鏡下高亮的熒光顆粒。通過結(jié)構(gòu)建模，我們發(fā)現(xiàn)由于突變的核纖層蛋白中的中性氨基酸纈氨酸被酸性氨基酸亮氨酸所取代，其免疫球蛋

15、白樣折疊中有三個β折疊以及多個側(cè)鏈均發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)論:
　　通過本研究，我們在一個具有高猝死風(fēng)險的家系中發(fā)現(xiàn)了核纖層蛋白的一個新的突變位點，年輕的先證者多次發(fā)生室速及室顫并有家族猝死史。突變氨基酸是位于疏水核心β2折疊上的保守氨基酸，通過研究這個位于第445位氨基酸殘基的錯義突變（纈氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的影響，我們發(fā)現(xiàn)突變的核纖層蛋白會降低鈉通道的峰值電流，而這一降低的鈉通道峰值電流通過早期除極導(dǎo)致惡

16、性心律失常及猝死的發(fā)生;不僅如此，由于點突變所導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)改變，使突變的核纖層蛋白在核膜周圍發(fā)生了聚集。
　　第三部分參松養(yǎng)心膠囊治療心動過緩的機制研究
　　背景
　　心動過緩是指每分鐘心率低于六十次，冠心病病人及老年人是心動過緩的高危人群。目前現(xiàn)有的可以加快心率的藥物有阿托品、多巴胺、異丙腎上腺素、腎上腺素等，但是這些藥物僅在需要時短期使用，而不會長期使用。如果藥物治療不能提高心率，那么病人可能就需要安裝臨時起搏器或者

17、永久起搏器。但是，就我國我現(xiàn)狀來看，起搏器的花費對普通家庭來說也是一筆不小的費用。所以，我們需要一種可以長期服用的，且可以有效的提高心率的藥物。我國傳統(tǒng)中藥治療心律失常已有數(shù)百年的歷史了，參松養(yǎng)心膠囊(ShenSongYangXin，SSYX)就是這樣一種歷史悠久的治療心率失常的傳統(tǒng)中藥。SSYX是由十二味中藥組成的復(fù)方制劑，其組分包括人參、麥冬、山茱萸、丹參等。前期全細(xì)胞膜片鉗的研究結(jié)果表明SSYX可以抑制多種離子通道的電流，還有研究

18、表明SSYX可以有效減少室性早搏的次數(shù)，并可以治療心動過緩。而且最近的一項隨機雙盲、安慰劑對照的多中心研究結(jié)果表明:SSYX可以有效治療心動過緩。盡管目前積累了不少來自于基礎(chǔ)和臨床的研究結(jié)果，但是SSYX是如何發(fā)揮其治療心動過緩的作用，尤其是它是通過影響哪些mRNA及蛋白從而發(fā)揮治療作用，這些問題仍是懸而未決。
　　目的
　　本研究利用心動過緩的動物模型研究SSYX治療心動過緩的分子機制，我們深入研究了SSYX給藥前后對模型

19、動物心臟組織的mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)數(shù)量的影響，力求全面揭示SSYX治療心動過緩的分子機制。
　　方法
　　我們將十八只兔子隨機分為三組:假手術(shù)組、模型組和SSYX治療組，然后記錄兔子的心率并從心臟提取總RNA。隨后，我們用基因芯片檢測心臟的差異mRNA并用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reversetranscription-polymerase chain reactio

20、n，RT-PCR)驗證了芯片的結(jié)果，為了驗證芯片的結(jié)果，我們還用膜片鉗記錄了SSYX給藥前后的鈣電流。最后，我們利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)檢測了SSYX用藥前后對模型動物心臟蛋白質(zhì)數(shù)量的影響。
　　結(jié)果
　　竇房結(jié)損傷六周后，模型組兔子的RR間期明顯延長，而SSYX給藥四周后，延長的RR間期又明顯縮短

21、。表達(dá)譜芯片的結(jié)果則說明SSYX顯著改變了心房的一些mRNA，這些mRNA包括影響起搏電流的mRNA、參與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的mRNA和信號通路相關(guān)mRNA。全細(xì)胞膜片鉗的結(jié)果也再次說明了SSYX抑制鈣電流，即確實會影響細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，這一結(jié)果也驗證了芯片的結(jié)果。此外，iTRAQ相對定量結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SSYX給藥后肌漿網(wǎng)及線粒體上轉(zhuǎn)運鈣離子的通道RyR2、鈣ATP酶和電壓依賴性陰離子通道的數(shù)量顯著增加，還有其他鈣離子結(jié)合蛋白的數(shù)量亦顯著增加;而參與