脾臟截留循環(huán)內(nèi)皮祖細胞及高原環(huán)境對大鼠顱腦損傷修復(fù)的影響.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全球范圍內(nèi)45歲以下人群致死致殘的首要原因，可以減少傷者的預(yù)期壽命。其中重型TBI患者死亡率高達35-70％，絕大部分幸存者均遺留不同程度的功能障礙，針對重型TBI迄今為止仍無有效的治療策略降低死殘率。重型TBI患者的死亡除與年齡大小、原發(fā)損傷嚴重程度、救治是否及時等因素有關(guān)外，繼發(fā)性腦損傷所致創(chuàng)傷性腦水腫已成為影響預(yù)后的重要因素。因此，如何有效控制繼發(fā)性腦損傷的進展以減輕創(chuàng)傷性腦水腫，對降低重型TBI死亡率具有

2、重要的臨床價值及科學意義。
　　TBI后血管新生是創(chuàng)傷后的一種保護性機制，可減輕神經(jīng)組織繼發(fā)性損傷。對TBI的研究目前主要聚焦于腦保護及神經(jīng)修復(fù)再生，而對腦組織缺血區(qū)供血血管關(guān)注甚少。研究證實在成年人外周血中存在的EPCs能分化為血管內(nèi)皮細胞，在體內(nèi)具有生成血管的能力，血管新生已成為當前再生醫(yī)學領(lǐng)域關(guān)注的熱點，隨著對EPCs認識的加深，既往認為只能靠成熟內(nèi)皮細胞對損傷血管進行有限修復(fù)的觀點被顛覆。EPCs在各種因素刺激下可從骨髓及

3、其它組織動員到循環(huán)血進行損傷的修復(fù)。近年來研究顯示，EPCs是參與生后生理性及病理性血管形成最主要的細胞，同時可在體內(nèi)分化為內(nèi)皮細胞，并參與腦、心、肝、腎等內(nèi)臟器官損傷時的修復(fù)。因此，EPCs在TBI后修復(fù)中具有重要的治療作用及廣闊的應(yīng)用前景。
　　BBB在維持CNS與血循環(huán)之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要作用，重型TBI后BBB破壞，繼發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫形成是重型TBI患者死亡的首要原因。近來研究認為BBB被推薦為TBI一個有希望的治療靶標，穩(wěn)

4、定BBB與神經(jīng)保護劑兩者結(jié)合可以提高治療成功率。在影響TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)及遠期預(yù)后的諸多因素中，BBB修復(fù)是其中尤為重要的因素;而EPCs可轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細胞參與血管新生并修復(fù)內(nèi)皮完整性，進而防止BBB損傷、加快神經(jīng)功能恢復(fù)。亦有研究表明循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴重程度及預(yù)后有關(guān)，可作為TBI預(yù)后的一個潛在標志物。
　　當前對重型TBI的大量研究多關(guān)注腦組織本身，針對外周免疫反應(yīng)對TBI的影響缺乏深入研究。近年來研究表明，TBI

5、后繼發(fā)性腦損傷過程中除致傷灶內(nèi)炎癥因子參與外，外周免疫系統(tǒng)亦參與了該過程，促進創(chuàng)傷性腦水腫形成，作為人體最主要的免疫器官，脾臟在TBI后腦水腫形成中有重要作用。脾臟亦是機體最大的淋巴器官，約占體重的0.2％，在清除衰老紅細胞、產(chǎn)生抗體及誘導(dǎo)免疫方面發(fā)揮重要功能，脾監(jiān)視循環(huán)并清除血中潛在威脅內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的異物。脾臟一直被認為是單核細胞的直接貯庫，機體損傷后動員大量單核細胞直接入脾，研究報道在炎性疾病中脾臟受累及，在脾臟中單核細胞數(shù)量不僅比循

6、環(huán)中高出數(shù)倍，而且在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定情況下心肌梗塞后受損心臟單核細胞數(shù)量亦超出循環(huán)。有研究報道實驗性卒中導(dǎo)致脾萎縮及脾源性促炎單核巨噬細胞動員進入血循環(huán)，進而聚集在缺血腦組織，脾尺寸的減少與腦梗塞面積程度呈負相關(guān)，卒中前2周行脾切除術(shù)具有神經(jīng)保護作用。
　　課題組前期研究證實，重型TBI大鼠傷后立即行脾臟切除，能夠有效減輕腦組織水腫程度，顯著降低大鼠死亡率，并能改善其認知功能，但具體機制尚不清楚。既然循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴重程度

7、及預(yù)后有關(guān)，而在TBI后行脾切除可以減輕腦水腫，兩者之間是否存在某種重要聯(lián)系？脾切除對循環(huán)EPCs水平及BBB通透性會產(chǎn)生什么影響？脾切除是否介導(dǎo)EPCs參與BBB重建？為驗證上述疑問，本研究設(shè)計如下實驗，以明確脾臟在重型TBI后對循環(huán)EPCs的調(diào)控及其參與BBB修復(fù)的機制。
　　除了從內(nèi)因方面探討了重型TBI后脾臟對EPCs的影響及其參與BBB修復(fù)、減輕了創(chuàng)傷性腦水腫，我們還從外因方面初步探討了環(huán)境改變對重型TBI后創(chuàng)傷性腦水腫

8、的影響，對常壓、低壓環(huán)境下穿透性腦損傷的傷情進行比較，以對高原條件下創(chuàng)傷性腦水腫的診治提供依據(jù)。
　　研究內(nèi)容:①建立重型TBI大鼠模型，觀察TBI后立即行脾臟切除對大鼠傷情的影響，主要從血常規(guī)、血糖、死亡率及腦水腫等方面觀察;②對重型TBI后3天大鼠循環(huán)血單個核細胞進行分離、培養(yǎng)及基本生物學特性鑒定;③脾切除對重型TBI大鼠循環(huán)血EPCs及S100B蛋白的影響及兩者間的相互關(guān)系，制模后不同時間點應(yīng)用流式細胞儀檢測循環(huán)血EPCs，

9、應(yīng)用ELISA檢測血漿S100B蛋白表達;④重型TBI大鼠BBB通透性的改變情況以及脾切除后對BBB通透性的影響;利用攜帶EGFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染EPCs，經(jīng)尾靜脈移植后，觀察EPCs移植后對創(chuàng)傷性腦水腫的影響及其參與血腦屏障重建的機制，應(yīng)用免疫熒光了解其歸巢至腦損傷灶情況，Westem blot檢測GFP及VEGF蛋白的表達;⑤對模擬高原穿透性顱腦損傷傷情的特點進行初步研究，通過建立穿透性腦損傷模型，從死亡率、組織病理改變、腦含水量、

10、EB含量、局部腦血流量、局部腦氧分壓、腦干聽覺誘發(fā)電位等方面比較常壓及低壓環(huán)境對穿透性腦損傷傷情的影響。
　　本次研究得出如下結(jié)果:①建立了穩(wěn)定的大鼠重型TBI模型;進一步印證了重型TBI大鼠傷后行脾切除可有效緩解腦水腫，提高生存率。②應(yīng)用密度梯度離心從循環(huán)血分離獲得的單個核細胞中存在EPCs，在內(nèi)皮條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下可由祖細胞向成熟細胞分化;所培養(yǎng)EPCs經(jīng)流式細胞儀鑒定具有EPCs表型特征，并可攝取DiI-Ac-LDL及結(jié)合

11、FITC-UEA-1;EPCs在Matrigel上能形成小管樣結(jié)構(gòu)。③重型TBI后循環(huán)血EPCs增加，脾切除后循環(huán)血EPCs增加更為顯著;重型TBI后血漿S100B蛋白表達增加，脾切除可以減少其表達;EPCs與血漿S100B蛋白呈正相關(guān)。④大鼠TBI后BBB通透性增加，脾切除可以改善BBB通透性;TBI后行EPCs移植減輕創(chuàng)傷性腦水腫;EPCs參與了TBI后BBB的重建，VEGF可能是EPCs修復(fù)血腦屏障的分子機制。⑤高原創(chuàng)傷性腦水腫較

12、常壓傷情重、發(fā)生快，持續(xù)時間長;早期持續(xù)的rCBF與PbtO2監(jiān)測對高原穿透性腦損傷的診治具有重要價值。
　　研究結(jié)論:1.重型TBI后BBB通透性升高，脾切除可改善BBB通透性;2.重型TBI后行脾切除可以升高循環(huán)EPCs，提示脾臟對骨髓來源的EPCs具有截留作用;3.重型TBI后EPCs移植可歸巢到損傷灶參與BBB重建，減輕創(chuàng)傷性腦水腫;4.高原創(chuàng)傷性腦水腫傷情重、發(fā)生快、持續(xù)時間長，早期持續(xù)的rCBF與PbtO2監(jiān)測對指導(dǎo)治