黃連素調(diào)動內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、本研究擬從動物試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)和人體試驗(yàn)，探討B(tài)R調(diào)動EPCs修復(fù)動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的效果和作用機(jī)制。 1、大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫模型的建立?！　》椒ǎ?2只雄性清潔級SD大鼠，脾臟切除兩周后，用隨機(jī)數(shù)字法將12只SD大鼠隨機(jī)等分為兩組：手術(shù)組(n=6)和假手術(shù)組(n=6)。頸部正中切口暴露左側(cè)頸總動脈及其分叉處，從分叉處向近心端游離頸總動脈約2 cm。從左頸外動脈向頸總動脈插入2F的Fogarty導(dǎo)管約1.5 cm，然后向?qū)?/p>

2、管內(nèi)注入200μl空氣，重復(fù)拉脫3次。最后結(jié)扎頸外動脈的游離端并縫合頸中部切口。假手術(shù)組只暴露左側(cè)頸總動脈及其分叉處，從分叉處向近心端游離頸總動脈約2cm。手術(shù)14 d后取損傷動脈段和對側(cè)的正常動脈。利用病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和電鏡技術(shù)等方法評價(jià)，拉脫模型建立的效果。 結(jié)論:利用2F的Fogarty球囊導(dǎo)管可以建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫模型。 2、大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定方法：　　方法：從大鼠下腔靜脈取外周

3、血共30ml，利用Ficoll-paque離心法得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。利用VEGF、bFGF和EGF在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，利用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定。 結(jié)論：利用VEGF、bFGF和EGF可以在體外將大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為EPC。 3、內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)大鼠頸總動脈內(nèi)皮損傷?！　》椒ǎ后w外誘導(dǎo)擴(kuò)增大鼠EPCs并利用Brdu進(jìn)行標(biāo)記。16只雄性SD大鼠，隨機(jī)等分為兩組，對照組和EPCs移植組。建立大鼠左頸總動

4、脈拉脫模型，隨后從頸外動脈向頸總動脈的損傷動脈段注入PBS溶液500μL含5×106個(gè)體外誘導(dǎo)分化并用Brdu標(biāo)記的EPCs，保持30 min后松開兩側(cè)的動脈夾以恢復(fù)血流；對照組只注入等量的PBS溶液500μL。最后結(jié)扎頸外動脈的游離端并縫合頸中部切口。14 d后取損傷動脈段和對側(cè)的正常動脈。利用病理學(xué)、免疫組織化學(xué)和圖象分析技術(shù)對修復(fù)效果進(jìn)行評價(jià)。 結(jié)論：EPCs可以定植到動脈損傷段并抑制新生內(nèi)膜的生長，說明EPCs具有修復(fù)動

5、脈損傷的作用。 4.血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelium growth faetor，VEGF)調(diào)動內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)動脈損傷的實(shí)驗(yàn)研究?！　》椒ǎ簩?2只雄性SD大鼠，隨機(jī)等分為兩組：VEGF組和對照組。每組中隨機(jī)選8只用于大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫模型的建立，另外8只用于抽血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用于抽血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的大鼠共注射7天藥物，方法為：VEGF組用5 μg／ml

6、的VEGF溶液200 μl／d，腹腔注射；對照組用PBS 200μl／d，腹腔注射。利用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)評價(jià)外周血中EPC的數(shù)目。用于建立模型的大鼠注射10天藥物，方法為：VEGF組用5 μg／ml的VEGF溶液200 μl／d，腹腔注射；對照組用PBS 200 μl／d，腹腔注射。用于建立動物模型的大鼠，在藥物注射7天時(shí)，利用Fogarty球囊導(dǎo)管建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫模型。并在手術(shù)后立即斷尾取血100μl，利用流式細(xì)

7、胞術(shù)評價(jià)外周血中Flk-1+的細(xì)胞比例。球囊損傷14天后，取損傷動脈段和對側(cè)正常動脈利用病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)和圖象分析技術(shù)進(jìn)行評價(jià)。 結(jié)論： VEGF具有調(diào)動EPCs修復(fù)動脈損傷的作用。 5.黃連素動員大鼠骨髓EPCs對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞依賴的舒張功能的影響?！　》椒ǎ?2只雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法等分為兩組：對照組(n=6)和黃連素(Berberine，BR)組(n=6)。對照組每天給予飼養(yǎng)用水2ml灌

8、胃；BR組每天給予15mg／ml的BR溶液45mg／Kg灌胃。藥物共干預(yù)6天，第7天用頸椎脫臼法處死大鼠，然后迅速取出胸主動脈約1cm，并從下腔靜脈取肝素抗凝血約5ml。利用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)測定BR干預(yù)7天后外周血中EPCs的數(shù)目。利用動脈環(huán)試驗(yàn)評價(jià)大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞依賴的動脈舒張功能。 結(jié)論：BR可以調(diào)動大鼠骨髓EPCs，BR調(diào)動骨髓EPCs可能是BR改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的一種機(jī)制。 6.BR動員大鼠骨髓EPCs

9、修復(fù)大鼠左頸總動脈內(nèi)皮損傷的研究?！　》椒ǎ?8只雄性SD大鼠建立大鼠左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫模型后，采用隨機(jī)數(shù)字法等分為三組：對照組(n=6)、BR組(n=6)和BR+L-NAME組(n=6)。動脈內(nèi)皮細(xì)胞拉脫術(shù)前4天開始藥物干預(yù)，共干預(yù)10天。 結(jié)論：BR可以調(diào)動大鼠骨髓EPCs，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能和加速損傷動脈的再內(nèi)皮化。eNOS／NO系統(tǒng)參與了BR調(diào)動EPCs的過程。 7.BR調(diào)動人體EPCs對內(nèi)皮細(xì)胞功能和動脈彈性

10、的影響?！　?方法：20位健康志愿者服用BR 30天，0.4g tid。志愿者服藥前和服藥30天后進(jìn)行生化指標(biāo)的測定。受試者在動脈彈性功能測定后臥位休息15 min，然后檢測受試者肱動脈對反應(yīng)性充血的內(nèi)皮依賴血管擴(kuò)張反應(yīng)(FMD)。服藥前后抽取外周血，利用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)測定服藥前后外周血中EPCs數(shù)目的變化 結(jié)論：BR可以調(diào)動人體EPCs，這可能是BR改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制之一。 8.BR對體外培養(yǎng)的EPCs