丙泊酚對不同TRPV1激動劑導致內(nèi)臟痛的矛盾作用.pdf

1、目的：在小鼠腹腔內(nèi)注射丙泊酚聯(lián)合醋酸或辣椒素，觀察其傷害反應來研究這一效果。
　　方法：
　　1.1 實驗動物
　　動物本研究均選用鼠齡6-8周，雄性C57BL/6J小鼠，體重20-22g，購置于中山大學醫(yī)學院實驗動物中心（中國，廣州）。小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(speceficpathogen free，SPF)自動調(diào)溫、調(diào)濕的動物實驗室中，自由飲水、進食，一天內(nèi)12h光照，室溫控制在22±1。C，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境為

2、12h晝夜節(jié)律變換，濕度控制在50％-70％的環(huán)境中。本研究中實驗動物的使用及處理方法均符合廣東省醫(yī)學科學院動物實驗倫理委員會的要求，并嚴格按照規(guī)定減少動物痛苦，盡可能減少實驗動物的使用數(shù)量。
　　1.2 腹腔內(nèi)注射醋酸、硫酸鎂和辣椒索引起的疼痛行為學觀察
　　小鼠于實驗前放置于透明有機玻璃盒(22 cm×12 cm×10 cm)內(nèi)預適應30min。30min后從盒子里取出，用胰島素注射針（30G針頭）腹腔注射0.01 ml

3、/g的0.6％醋酸和5mM丙泊酚的混合溶液（對照組2.5％ DMSO+0.01 ml/g的0.6％醋酸）、0.6mg/g的6mg/ml硫酸鎂和5mM丙泊酚的混合溶液（對照組2.5％DMSO+0.6mg/g的6mg/ml硫酸鎂）或者200uM辣椒素與5mM丙泊酚的混合溶液（對照組4.5％ DMSO+200uM辣椒素），腹腔注射藥物后立即放入有機玻璃盒內(nèi)進行觀察，整個過程要注意減少對動物的刺激，特別是腹腔注射動作要輕柔,以免刺激小鼠致其活動

4、量減少，影響行為學的觀察。觀察并用手動計數(shù)器記錄每只動物腹腔注射醋酸和硫酸鎂混合溶液后30 min內(nèi)小鼠扭體反應的次數(shù)（如腹部收縮、扭動軀干、弓背、伸展后肢等）和用秒表計時器記錄腹腔注射辣椒素后10min內(nèi)小鼠傷害反應的總時間（如低頭彎腰縮成團的姿勢、腹部朝上臥倒的姿勢）。一只動物只作一次實驗，每組有10只小鼠。一次同時觀察4只小鼠，處理組和對照組各2只。為盡可能減小晝夜時間因素對小鼠相關行為的影響，本研究中所有動物行為學實驗均在9:0

5、0至17:00之間進行。
　　1.3 去除TRPV1神經(jīng)元小鼠的制備
　　雄性新生小鼠于出生后第二天七氟醚麻醉后皮下注射辣椒素(50 mg/kg)，對照組注射同樣容量的溶劑(PBS含10％ ethanol與10％ Tween-80)，動物在SPF動物房里面飼養(yǎng)6周后進行實驗。新生期注射辣椒素能夠去除表達TRPV1神經(jīng)元，用角膜刺激實驗驗證去除TRPV1神經(jīng)元的效果，用0.01％辣椒素20μl噴到小鼠眼睛上，小鼠會用前肢拂拭眼

6、睛，記數(shù)1 min內(nèi)用前肢拂拭眼睛的次數(shù)，如1 min內(nèi)用前肢拂拭眼睛的次數(shù)少于5次就認為已經(jīng)成功去除TRPV1神經(jīng)元。
　　2.結(jié)果：
　　2.1 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加醋酸引起的扭體反應
　　使用2mM的丙泊酚聯(lián)合總量為0.01 ml/g的0.6％醋酸在小鼠腹腔內(nèi)注射后發(fā)現(xiàn)，與單獨注射0.01 ml/g的0.6％醋酸相比，每5分鐘的扭體反應數(shù)量沒有差距，而30分鐘內(nèi)實驗組總體的小鼠扭體反應比對照組要高，分別為53

7、.5±9.2次和40.3±3.6次(P=0.02)。但是兩組之間在發(fā)生扭體反應的潛伏期上沒有統(tǒng)計學差異，分別為141±10秒和116±8秒，(P=0.47)。
　　腹腔內(nèi)注射5mM丙泊酚不引起小鼠的傷害反應。腹腔內(nèi)注射0.6％醋酸引起小鼠30分鐘內(nèi)31±6.9次的扭體反應，并且潛伏期少于2分鐘。我們的觀察證實了注射醋酸后的扭體反應主要發(fā)生在30分鐘內(nèi)。聯(lián)合注射5mM丙泊酚和0.6％醋酸使小鼠30分鐘內(nèi)的扭體反應增加到42.8±9.

8、2次(P＜0.05)。
　　2.2 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚增加硫酸鎂引起的扭體反應
　　腹腔內(nèi)注射6mg/ml硫酸鎂0.6mg/g引起小鼠30分鐘內(nèi)13.7±2.9次的扭體反應，聯(lián)合注射5mM丙泊酚后，使小鼠30分鐘內(nèi)的扭體反應增加到25.3±4.8次(P＜0.001)。
　　2.3 腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚減少辣椒素導致的傷害反應時間
　　腹腔內(nèi)注射200μM辣椒素后10秒內(nèi)導致小鼠的傷害反應時間為371±82.7秒

9、，這些反應10分鐘后消失。腹腔內(nèi)聯(lián)合注射200.M辣椒素和5mM丙泊酚后，小鼠的傷害反應時間大幅度縮短至67±39秒(P＜0.05)。
　　2.4 TRPV1對腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚的影響
　　為了明確TRPV1對丙泊酚在致痛物質(zhì)引起的小鼠傷害反應中的作用，給出生2天的小鼠皮下注射50mg/kg辣椒素，當它們成年后再腹腔內(nèi)注射醋酸、硫酸鎂或者辣椒素。經(jīng)過辣椒素處理后的成年小鼠，腹腔內(nèi)注射6mg/ml硫酸鎂和200μM辣椒素后沒

10、有任何的腹部向上臥倒或者低頭彎腰坐立的傷害反應;腹腔內(nèi)注射0.6％醋酸后，30分鐘內(nèi)的扭體反應為20±4.1次，顯著少于對照組經(jīng)過溶媒處理后成年小鼠腹腔內(nèi)注射0.6％醋酸后30分鐘內(nèi)的扭體反應33±5.8次;腹腔內(nèi)聯(lián)合注射5mM丙泊酚和0.6％醋酸后，30分鐘內(nèi)的扭體反應為16±3.9次，顯著少于單純注射0.6％醋酸后30分鐘內(nèi)的扭體反應21±3.6次。
　　本研究中腹腔內(nèi)聯(lián)合注射丙泊酚時，醋酸誘導的扭體反應增加，表明丙泊酚具有促

11、傷害作用。已有研究證實，腹腔內(nèi)注射醋酸主要通過TRPV1介導導致扭體反應。所以，經(jīng)大劑量辣椒素處理清除了TRPV1的新生小鼠成年后，向其腹腔內(nèi)注射醋酸導致的扭體反應顯著減少。TRPV1是一種依賴鈣離子的非選擇性陽離子通道，可以被辣椒素、質(zhì)子、陽離子、傷害性溫度刺激和包括脂質(zhì)代謝產(chǎn)物在內(nèi)的內(nèi)源性配體直接激活。在包括內(nèi)皮素和緩激肽在內(nèi)的“炎癥池”物質(zhì)聯(lián)合作用下，可以降低TRPV1的激活閾值。從小靜脈注射丙泊酚時，經(jīng)常導致注射痛，緩激肽和前列

12、腺素在其中發(fā)揮重要的作用。對大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元使用較大劑量的TRPV1激動劑導致TRPV1的敏感性下降，而丙泊酚可以通過PKCε和TRPA1途徑使其敏感性恢復。在基因敲除31和B2的小鼠中，醋酸導致的內(nèi)臟傷害反應大約減少70％?？梢?，丙泊酚也許是通過敏化TRPV1增強了醋酸的傷害作用。然而，很難解釋相同劑量的丙泊酚會減弱辣椒素的傷害反應。
　　一些研究證實，全身注射大劑量的丙泊酚在導致正常反射消失外，還會產(chǎn)生止痛作用，而全身

13、注射亞催眠劑量的丙泊酚會產(chǎn)生致痛作用。腹腔內(nèi)注射亞催眠劑量的丙泊酚，或者側(cè)腦室和中腦導水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)注射微量的丙泊酚會產(chǎn)生顯著的致痛作用，這一結(jié)論已通過清醒大鼠的熱板痛覺實驗和福爾馬林實驗所證實，而椎管內(nèi)注射丙泊酚顯示出良好的止痛作用。因此，人們認為丙泊酚通過脊髓上機制產(chǎn)生致痛作用。熱板痛覺試驗表明，小鼠腹腔內(nèi)注射丙泊酚產(chǎn)生抗傷害作用，而醋酸導致的小鼠扭體反應是通過N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic a

14、cid，NMDA)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）途徑完成的。聯(lián)合注射丙泊酚可以抑制蜂毒導致的疼痛反應。
　　綜上所述，丙泊酚使用的劑量和途徑?jīng)Q定了產(chǎn)生止痛作用還是致痛作用。
　　與之前的研究不同，我們的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)聯(lián)合注射相同劑量的丙泊酚同時表現(xiàn)出致痛作用和止痛作用。它增加了醋酸和硫酸鎂導

15、致的扭體反應，同時也降低了辣椒素導致的傷害時間。我們的研究顯示，經(jīng)過辣椒素處理的新生小鼠，成年后聯(lián)合注射丙泊酚和醋酸的扭體反應減少，與丙泊酚的TRPV1作用有關。
　　丙泊酚鼻內(nèi)輸注導致的疼痛反應和動脈內(nèi)注射導致的屈肌反射都是由TRPA1介導的。只有表達TRPA1的神經(jīng)元，丙泊酚才能引起內(nèi)向電流，而對于轉(zhuǎn)染了TRPV1的HEK293細胞，丙泊酚并不能引起內(nèi)向電流。有研究表明，丙泊酚不能改變辣椒素和TRPV1的結(jié)合反應。然而，另一個

16、研究證明，丙泊酚使轉(zhuǎn)染了Wistar大鼠TRPV1 cDNA的HEK293細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。對于轉(zhuǎn)染了人TRPV1 cDNA的HEK293細胞，聯(lián)合使用辣椒素和丙泊酚的內(nèi)向電流反而比單獨使用辣椒素的內(nèi)向電流小。這些研究都表明丙泊酚和TRPV1之間有著功能上的關聯(lián)。
　　某些激動劑直接與TRPV1結(jié)合的同時，也起到強化介質(zhì)的作用。例如，輕微的酸性環(huán)境能降低TRPV1的溫度閾值并增強熱刺激和辣椒素導致的電流。雞的TRPV1對辣椒素

17、不敏感，但是高濃度的辣椒素可以增強質(zhì)子激發(fā)的電流。當不同物質(zhì)對同一受體的結(jié)合位點有重合時，會導致競爭性拮抗，例如，陽離子和質(zhì)子都作用于TRPV1上的E600和E648區(qū)域。鎂離子在1-10mM的環(huán)境下敏化TRPV1，在5-10mM的環(huán)境下阻止了TRPV1與質(zhì)子的反應。丙泊酚可能在細胞膜內(nèi)和TRPV1發(fā)生作用，或者與TRPV1穿越脂質(zhì)雙分子層的疏水區(qū)相結(jié)合，因為丙泊酚是脂溶性的并且具有穿透細胞膜的能力。
　　結(jié)論：
　　我們的