大腸埃希菌micC啟動(dòng)子相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　micC是一種編碼小分子非編碼RAN(small non-coding RNA,sRNA)的基因，存在于多種革蘭陰性細(xì)菌基因組內(nèi)。micC位于E.coli基因組ompN與ybdK基因之間，其中ompN與ybdK轉(zhuǎn)錄方向一致，而與micC轉(zhuǎn)錄方向相反。micC啟動(dòng)子位于ompN與micC基因間，長度為227個(gè)堿基對(duì)（base pair,bp）。該啟動(dòng)子是否具有雙向轉(zhuǎn)錄活性還未知曉，micC的應(yīng)激性表達(dá)仍有待進(jìn)一步探索。本

2、文對(duì)micC啟動(dòng)子的雙向轉(zhuǎn)錄活性、micC應(yīng)激性表達(dá)進(jìn)行了研究。
　　方法：
　?。?）本研究以大腸埃希菌DH5為實(shí)驗(yàn)菌株，用天根生物科技公司產(chǎn)的試劑盒提取其基因組，以其為模板，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增micC基因227bp、485bp的5＇側(cè)翼序列，并分別正向、反向連接到質(zhì)粒pJRS462表達(dá)β-葡萄糖苷酸酶（be ta-gluc uro nidase，gus）報(bào)告基因的上游構(gòu)建報(bào)告載體，檢測攜帶各報(bào)告載體菌株的GUS活性。

3、>　?。?）在實(shí)驗(yàn)（1）正反向啟動(dòng)子都有活性的情況下，利用Red重組系統(tǒng)將各啟動(dòng)子連同gus報(bào)告基因和卡那霉素抗性基因重組到DH5ɑ基因組上，對(duì)啟動(dòng)子特性進(jìn)行驗(yàn)證。
　?。?）檢測各重組菌在各種應(yīng)激條件下的GUS活性，如溫度、酸堿度、滲透壓、抗生素、氧化應(yīng)激刺激等。
　　結(jié)果：
　?。?）250bp和500bp的DNA片段正向、反向插入到質(zhì)粒gus報(bào)告基因上游后，均檢測出gus基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組GUS活性是陰性對(duì)照組的兩

4、倍以上。
　　（2）啟動(dòng)子連同gus基因和篩選標(biāo)記成功重組到DH5ɑ基因組上；重組菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期后GUS活性大幅度提高。
　?。?）在不同應(yīng)激環(huán)境下，各重組菌gus基因表達(dá)水平不盡相同：GUS活性隨著溫度升高而升高，隨著溫度的降低而降低；GUS活性隨著滲透壓的增高而降低；氧化應(yīng)激條件下，正向啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS活性表達(dá)升高，而反向啟動(dòng)子GUS活性無顯著變化；在pH應(yīng)激下，GUS活性無明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1

5、.介于micC與ompN基因間的DNA序列為一個(gè)雙向啟動(dòng)子。
　　2.同一長度的啟動(dòng)子其正、反向間的轉(zhuǎn)錄活性沒有差異。
　　3.細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期后micC啟動(dòng)子表達(dá)大幅度提高。
　　4. micC啟動(dòng)子主要受溫度和滲透壓刺激的調(diào)節(jié)：在溫度升高時(shí)，正反向啟動(dòng)子表達(dá)都增高，反之都降低；正反向啟動(dòng)子在高滲下表達(dá)都降低。
　　5.氧化應(yīng)激促進(jìn)正向啟動(dòng)子表達(dá)，而對(duì)反向啟動(dòng)子表達(dá)沒有影響。
　　6. micC啟動(dòng)子對(duì)pH