miR-183介導(dǎo)EMT在肺腺癌細(xì)胞放射抗拒中的作用探討.pdf

1、目的：
　　放療是非小細(xì)胞肺癌治療的主要手段之一，放射抵抗是影響NSCLC放療療效的重要原因，EMT是放射抵抗產(chǎn)生的主要原因。研究表明肺腺癌放射抗拒細(xì)胞發(fā)生了EMT表型的改變，且miR-183在肺腺癌放射抗拒細(xì)胞株中表達(dá)增高，提示miR-183可能介導(dǎo)EMT并在肺腺癌細(xì)胞放射抗拒中發(fā)揮作用。因此對(duì)miR-183調(diào)控機(jī)制的深入探討，將有望闡明其與EMT的關(guān)系及二者在肺腺癌細(xì)胞放射抵抗中的作用，為臨床上尋找提高NSCLC放射治療療效的

2、靶點(diǎn)提供新的思路。
　　方法：
　　倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較不同細(xì)胞接受相同劑量照射后細(xì)胞生存率的差異；克隆形成實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞放射抗拒性能之間的差異；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞遷移能力的改變；qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-183的表達(dá)，qPCR及Western Blot分別檢測(cè)ZEB1及EMT相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA及蛋白表達(dá)水平的改變；慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)對(duì)H1299及H1299R細(xì)胞中miR-183基

3、因的上/下調(diào)。
　　結(jié)果：
　　1.X射線持續(xù)照射后，肺腺癌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化，由原本緊密連接的上皮細(xì)胞形態(tài)變成連接疏松、形態(tài)狹長并伸出偽足的類似成纖維細(xì)胞形態(tài)；在課題組前期的研究中：克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，相比于H1299細(xì)胞，H1299R細(xì)胞的存活肩區(qū)更寬，放射抗拒性更強(qiáng)（P<0.05）；CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，相比于H1299細(xì)胞，H1299R細(xì)胞在接受亞致死劑量（6Gy）X射線照射后，表現(xiàn)出更高的生存率（P<0.05

4、）；qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-183、ZEB1、Vimentin在H1299R細(xì)胞中高表達(dá)（P<0.05），E-cadherin表達(dá)變化無差異（P>0.05）；Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZEB1、Vimentin在H1299R細(xì)胞中高表達(dá)，E-cadherin表達(dá)降低（P<0.05）。
　　2.成功構(gòu)建干擾miR-183表達(dá)的慢病毒載體，qPCR驗(yàn)證miR-183在H1299R-shRNA-miR183細(xì)胞中表達(dá)降低（P<

5、0.05）。進(jìn)一步克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，相比于陰性對(duì)照H1299R-shRNA-NC細(xì)胞，干擾miR-183表達(dá)后的H1299R-shRNA-miR183細(xì)胞的存活肩區(qū)變窄，放射抗拒性減弱（P<0.05）；CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，相比于H1299R-shRNA-NC細(xì)胞，H1299R-shRNA-miR183細(xì)胞在接受4Gy X射線照射后，生存率降低（P<0.05）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H1299R-shRNA-miR183細(xì)胞的劃痕愈合

6、時(shí)間相對(duì)延長，細(xì)胞遷移能力減弱（P<0.05）；qPCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在基因及蛋白水平ZEB1、Vimentin在 H1299R-shRNA-miR183細(xì)胞中表達(dá)均降低，E-cadherin表達(dá)均相對(duì)增高（P<0.05）。
　　3.成功構(gòu)建miR-183上調(diào)表達(dá)的慢病毒載體，qPCR驗(yàn)證miR-183在H1299-EGFP-miR183細(xì)胞中表達(dá)增高（P<0.05）。進(jìn)一步克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，相比于陰性對(duì)照H1

7、299-EGFP-NC細(xì)胞，miR-183上調(diào)表達(dá)后的H1299-EGFP-miR183細(xì)胞的存活肩區(qū)變寬，放射抗拒性增強(qiáng)（P<0.05）；CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，相比H1299-EGFP-NC細(xì)胞，H1299-EGFP-miR183細(xì)胞在接受4Gy X射線照射后，生存率增高（P<0.05）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H1299-EGFP-miR183細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間相對(duì)縮短，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（P<0.05）；qPCR及Western B

8、lot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在基因及蛋白水平ZEB1、Vimentin在H1299-EGFP-miR183細(xì)胞中表達(dá)均增高，而E-cadherin表達(dá)均相對(duì)降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.持續(xù)X射線照射過程中，H1299細(xì)胞發(fā)生了EMT，其增殖活性增強(qiáng)，放射抗拒能力增加；
　　2.miR-183在H1299細(xì)胞發(fā)生放射抗拒的過程中表達(dá)增高，并在其中發(fā)揮重要作用：過表達(dá)miR-183的表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)H1299細(xì)胞發(fā)生EM