miR-205介導(dǎo)VEGF促卵巢癌細(xì)胞侵襲機(jī)制的初探.pdf

1、背景與目的:卵巢癌是婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤。由于卵巢癌早期癥狀不明顯，且生長(zhǎng)迅速并易擴(kuò)散，往往在患者確診時(shí)已處于卵巢癌的晚期，因此對(duì)卵巢癌侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要的理論與臨床價(jià)值。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)是一種對(duì)脈管新生具有促進(jìn)作用的生長(zhǎng)因子。已有多項(xiàng)研究證實(shí)VEGF參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移。本課題的前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用比較蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與卵巢

2、癌侵襲高度相關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì):Ezrin和Lamin A/C在VEGF誘導(dǎo)前后的表達(dá)存在顯著差異，推測(cè)它們很可能參與了VEGF對(duì)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為一類(lèi)短鏈非編碼RNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此miRNA的作用機(jī)制備受關(guān)注。本課題利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)miRNA靶標(biāo)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-205在Ezrin、Lamin A/C的3'UTR均有結(jié)合位點(diǎn)。由此推測(cè)miR-205與VEGF介導(dǎo)的差異蛋

3、白Ezrin、Lamin A/C間存在調(diào)控關(guān)系。miR-205是否參與了對(duì)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控？為回答上述問(wèn)題，本課題展開(kāi)了miR-205介導(dǎo)VEGF促卵巢癌細(xì)胞侵襲機(jī)制的初步研究。
　　 方法:(1)培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系HO-8910（低轉(zhuǎn)移株）、HO-8910PM（高轉(zhuǎn)移株）、SKOV-3（低轉(zhuǎn)移株）及SKOV-3ip（高轉(zhuǎn)移株）4株配對(duì)的細(xì)胞系。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGFR（包括VEGFR1和VEGFR2）在HO-

4、8910細(xì)胞中的表達(dá)。(3) Transwell小室模型檢測(cè)VEGF處理低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株前后細(xì)胞侵襲能力的變化。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VEGF處理低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株前后細(xì)胞的凋亡情況。(5)MTT法測(cè)定VEGF處理低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株前后細(xì)胞的增殖能力變化。(6)miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)VEGF處理HO-8910細(xì)胞前后miRNA的表達(dá)譜變化，并使用IPA軟件分析差異蛋白和差異miRNA構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。(7) Real time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Ezr

5、in、Lamin A/C mRNA及miR-205的表達(dá)水平。(8) Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Ezrin、LaminA/C蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)在接種數(shù)目、培養(yǎng)條件與時(shí)間相同的情況下，HO-8910PM和SKOV-3ip較HO-8910和SKOV-3生長(zhǎng)速度快、細(xì)胞數(shù)目多。(2) VEGFR1和VEGFR2在卵巢癌細(xì)胞HO-8910中均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。(3) VEGF處理低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株后，細(xì)胞的侵襲能力

6、增強(qiáng)(P＜0.05)。(4) VEGF處理低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株后，細(xì)胞的凋亡數(shù)減少(P＜0.05)。(5) VEGF處理低轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株后，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力降低(P＜0.05)。(6) miRNA芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF處理HO-8910后，有32種差異表達(dá)的miRNA(P＜0.05)，其中18種上調(diào)，14種下調(diào)，IPA軟件顯示差異表達(dá)miRNA與前期發(fā)現(xiàn)的17個(gè)差異蛋白直接的作用通路共11條，與miR-205有關(guān)的調(diào)節(jié)通路有4條。(

7、7) Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理時(shí)Ezrin mRNA在高轉(zhuǎn)移的HO-8910PM及SKOV-3ip細(xì)胞中表達(dá)均較低轉(zhuǎn)移組低(P＜0.05)，但Lamin-A/C mRNA在兩組轉(zhuǎn)移性不同的細(xì)胞系中表達(dá)變化不一致，即Lamin-A/C mRNA在高轉(zhuǎn)移的HO-8910PM表達(dá)明顯較低(P＜0.05)，而在高轉(zhuǎn)移的SKOV-3ip細(xì)胞中卻表達(dá)升高(P＜0.05)。VEGF處理后低轉(zhuǎn)移組中Ezrin、Lamin A/C的mR

8、NA水平均有意義下調(diào)(P＜0.05)，同時(shí)miR-205的表達(dá)水平則升高(P＜0.05)。(8) Western blot顯示VEGF誘導(dǎo)HO-8910和SKOV-3細(xì)胞24小時(shí)后，Lamin-A/C蛋白和Ezrin蛋白在HO-8910和SKOV-3細(xì)胞中的表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:(1) VEGF能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞系的侵襲能力，抑制其凋亡。(2) VEGF能下調(diào)卵巢癌細(xì)胞系中Ezrin、Lamin-A/C的mRN