MK和GM-CSFRα在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)與功能研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)是一類來源于早期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)的多能性(Pludpotency)細(xì)胞群體．ESC依賴一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)維持其多能性的細(xì)胞狀態(tài)。而構(gòu)成這一網(wǎng)絡(luò)的各種多能性相關(guān)分子共同決定著ESC的命運(yùn)．當(dāng)前已知的ESC多能性相關(guān)分子仍然十分有限，其功能研究也存在明顯不足．尋找新的多能性相關(guān)分子及其功能成為胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)理論研究的一個(gè)重要部分。同時(shí)ESC理論

2、研究的深入無疑也將大大推動ESC細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的發(fā)展。
　　 中期因子(Midkine，MK)是一種分子量為13kDa的肝素結(jié)合生長因子，它在許多細(xì)胞中都有著重要的功能，包括促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制凋亡。MK最早在維甲酸（RA）誘導(dǎo)的小鼠胚胎癌細(xì)胞(mECC)中被發(fā)現(xiàn)。為了研究其在ESC中的功能，我們首先通過免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)和RT-PCR分析了ESC中MK的表達(dá)，并在小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)自發(fā)分化體系中探討了MK隨著

3、mESC分化的表達(dá)變化。隨后我們分別在有飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層mESC培養(yǎng)體系中比較了添加和不添加MK條件下mESC自我更新能力的差異．最后我們通過Westernblotting、流式細(xì)胞儀和細(xì)胞周期分析探討了MK作用于mESC的機(jī)理。結(jié)果表明MK及其受體PTP在mESC和人胚胎干細(xì)胞(hESC)中均存在強(qiáng)陽性表達(dá)．自發(fā)分化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明隨著分化的進(jìn)行，MK的表達(dá)隨著mESC多能性的丟失而減弱。而外源添加高濃度的MK能有效促進(jìn)mESC的增殖和

4、集落形成，并抑制其自發(fā)分化。這一作用的產(chǎn)生是由于添加的MK提高了mESC胞內(nèi)AKT的磷酸化水平進(jìn)而活化了PI3K/AKT信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期聚集，并減弱了mESC的自發(fā)凋亡．相反添加PI3K抑制劑LY294002有效阻斷了MK對mESC自我更新的這一促進(jìn)作用。因此我們認(rèn)為在mESC常規(guī)培養(yǎng)過程中，MK通過自分泌或旁分泌促進(jìn)了ESC的自我更新。這一發(fā)現(xiàn)首次從蛋白水平證明了MK在ESC中的表達(dá)及功能，豐富了我們有關(guān)ESC

5、胞外因子微環(huán)境的知識．而ESC中MK/PTP~信號通路的揭示也將進(jìn)一步加深我們對多能性調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識。
　　 抗體能識別其相應(yīng)的抗原，且具有極高的特異性，因此利用單克隆抗體技術(shù)尋找新的ESC特異性功能分子無疑是多能性相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)的另一條有效途徑．本研究中我們通過大劑量ESC活細(xì)胞免疫新西蘭大白兔，并經(jīng)ICC篩選獲得了305個(gè)分泌mESC陽性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，就我們所知這是目前最大的mESC特異性單克隆抗體庫。從中挑選出來

6、優(yōu)先研究的20個(gè)抗體展現(xiàn)了不同的ICC和流式染色，說明全細(xì)胞免疫產(chǎn)生兔單克隆抗體可作為細(xì)胞特異性抗體產(chǎn)生的有效方法，這20個(gè)抗體的ICC和流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示了不同抗原在mESC中的不同表達(dá)比例，顯示了這些抗原在mESC中異質(zhì)性的表達(dá)規(guī)律。而從中篩選得到的一個(gè)抗體，其抗原表達(dá)隨ESC的分化而降低，說明該抗原與ESC的多能性相關(guān)。進(jìn)一步免疫沉淀(IP)提取抗原并經(jīng)質(zhì)譜鑒定表明該抗原為粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體a(GM-CSFRa)。

7、這一新發(fā)現(xiàn)表達(dá)于ESC細(xì)胞膜表面的GM-CSFRa，其表達(dá)緊隨ESC的分化而快速下降，提示了它在ESC中發(fā)揮重要功能。
　　 ESC的理論研究為臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，已有研究表明ROCK抑制劑Y-27632能有效促進(jìn)單個(gè)分散hESC的存活，在我們的研究中，通過Y-27632的處理，成功誘導(dǎo)hESC分化為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)樣細(xì)胞。進(jìn)一步的細(xì)胞表面標(biāo)志分析和分化潛能分析表明我們分化得到的hESC來源的MSC(hESC-MSC)具有

8、成體MSC典型的細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志（包括CD73、CDI05、CD166陽性而CD34陰性），并能有效分化為成骨和脂肪細(xì)胞。不僅如此，我們分化得到的hESC-MSC還表現(xiàn)出MSC類似的免疫調(diào)節(jié)特性，能在體外的混合淋巴反應(yīng)中抑制淋巴細(xì)胞增殖。在CCI4誘導(dǎo)的小鼠肝炎癥模型中，能夠遷移到炎癥部位并在炎癥部位存活，進(jìn)而抑制炎癥部位的淋巴細(xì)胞浸潤．我們獲得的hESC-MSC在異源性免疫勝任環(huán)境中的這一獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)能力，預(yù)示了它良好的應(yīng)用前景．