微粒體Ⅱ相代謝酶在小鼠胚胎干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的表達(dá)及其代謝功能研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES cells)是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹胚分離后。能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)并保持高度未分化的全能細(xì)胞系。具有無(wú)限的分化潛能是其突出特點(diǎn)之一，即給予合適的培養(yǎng)條件，ES緬胞可在體外分化為外、中、內(nèi)胚層的任何類型類細(xì)胞。研究證明利用形成擬胚體(embryoid bodies，EBs)培養(yǎng)，三胚層結(jié)構(gòu)可通過(guò)細(xì)胞因子和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互誘導(dǎo)分化形成肝細(xì)胞，重演體內(nèi)肝臟的發(fā)育過(guò)程，分化得到的肝細(xì)胞具

2、有體內(nèi)正常肝細(xì)胞或原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的特征和功能：(1)在肝細(xì)胞分化之前形成．EBs具有典型的三胚層結(jié)構(gòu)；(2)在ES細(xì)胞分化過(guò)程中，時(shí)空依賴性地表達(dá)肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和肝細(xì)胞特異基因；(3)分化得到的肝細(xì)胞具有典型的雙核表型，并能合成和分泌白蛋白和尿素等；(4)分化得到的肝細(xì)胞表達(dá)微粒體Ⅰ相代謝酶并具有活性;(5)分化得到的肝細(xì)胞成功應(yīng)用于CCl4毒性研究．具有應(yīng)用于藥物毒性初篩的前景。正是因?yàn)檫@些特征，ES細(xì)胞體外分化為肝細(xì)胞在下列領(lǐng)

3、域的研究前景被逐漸引起關(guān)注：肝臟發(fā)育研究模型；藥物代謝和藥效毒性研究模型；肝臟衰竭的細(xì)胞治療和組織工程中應(yīng)用。 鑒于ES細(xì)胞的上述應(yīng)用前景，有必要對(duì)ES細(xì)胞分化的肝細(xì)胞功能特征作全面深入研究。其中代謝功能是肝細(xì)胞極其重要的特征，通過(guò)代謝可以將內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)排出體外，起到排毒解毒維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。但迄今關(guān)于ES細(xì)胞分化肝細(xì)胞代謝酶研究的報(bào)道甚少，尤其未見關(guān)于微粒體Ⅱ相酶表達(dá)及其活性的報(bào)道。 另由于ES細(xì)胞分化的

4、肝細(xì)胞應(yīng)用于藥物研究．與其它來(lái)源細(xì)胞(原代肝細(xì)胞，HepG2腫瘤來(lái)源永生化細(xì)胞)相比，具有在功能上比較完善而且實(shí)驗(yàn)維持時(shí)間長(zhǎng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因此本研究構(gòu)建由：ES細(xì)胞分化的肝細(xì)胞，并探索其是否具有微粒體Ⅱ相代謝酶的功能，為藥物代謝研究的替代模型等提供依據(jù)。 目的：構(gòu)建ES細(xì)胞體外分化為肝細(xì)胞平臺(tái)技術(shù)，為研究其代謝酶表達(dá)及功能提供實(shí)驗(yàn)體系。 方法：采用ES細(xì)胞懸滴培養(yǎng)分化技術(shù)，形成EBs后，不添加任何誘導(dǎo)因子分化形成肝細(xì)胞。用

5、RT-PCR法檢測(cè)ES細(xì)胞分化肝細(xì)胞過(guò)程的發(fā)育依賴性基因的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞表型及特異性標(biāo)記物白蛋白(albumin，ALB)表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)分化得到肝細(xì)胞上清液的自蛋白含量，以評(píng)價(jià)其合成和分泌功能。 結(jié)果：隨著ES細(xì)胞分化時(shí)程，呈下述典型發(fā)育依賴性特征。RT-PCR結(jié)果顯示，未分化特征基因OCT3/4的表達(dá)迅速下降，分化至d 18完全消失；未成熟肝細(xì)胞特征基因(a-fetoprotein，AFP)在分化中先

6、增加后下降的趨勢(shì)，至d 18僅見少量表達(dá)；標(biāo)志成熟肝細(xì)胞特征基因ALB在分化過(guò)程中逐漸增加；而肝細(xì)胞代謝成熟特征基因Cyp7al在分化d 18時(shí)有表達(dá)，表示在基因?qū)用?，ES細(xì)胞分化形成成熟肝細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)顯示呈典型的肝細(xì)胞雙核結(jié)構(gòu)，特異性標(biāo)記物ALB呈陽(yáng)性表達(dá)，提示已分化形成成熟肝細(xì)胞。通過(guò)ELISA法檢測(cè)到ES細(xì)胞分化肝細(xì)胞在分化d 8出現(xiàn)白蛋白的分泌，隨著肝細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成熟，白蛋白含量逐漸遞增，d 18達(dá)到平臺(tái)期，提示所分化的

7、肝細(xì)胞具備成熟肝細(xì)胞的分泌功能。 結(jié)論：采用ES細(xì)胞懸滴培養(yǎng)分化技術(shù)，d 18時(shí)顯示呈典型的肝細(xì)胞雙核結(jié)構(gòu)，特異性標(biāo)記物ALB呈陽(yáng)性表達(dá)，白蛋白含量逐漸遞增達(dá)到平臺(tái)期，提示已分化為成熟肝細(xì)胞。 第二部分微粒體Ⅱ相代謝酶在ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞中的表達(dá) 目的：探索ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞過(guò)程中，若干微粒體Ⅱ相酶基因及蛋白的表達(dá)，為研究其代謝功能提供依據(jù)。 方法：ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞過(guò)程中，用RT-PCR法檢測(cè)Ⅱ代

8、謝酶UGT1a1、UGT1a6、UGT1a9、UGT2b5和maGST1基因表達(dá)；用western-blot法檢測(cè)UGTal、UGT1a6、mGsT1蛋白表達(dá)。 結(jié)果與結(jié)論：在ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞過(guò)程中，基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果顯示，UGT1a1和UGT1a9表達(dá)較穩(wěn)定；UGT2b5在分化過(guò)程中未見表達(dá):UGT1a6和mGST1的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。蛋白表達(dá)則顯示UGT1a1呈上升趨勢(shì)；UGT1a6和mGST1在分化早期和中期表達(dá)甚微，在分化d

9、 18有較高表達(dá)。提示在分化d 18的肝細(xì)胞已經(jīng)具有Ⅱ相代謝酶代謝功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。 第三部分微粒體Ⅱ相代謝酶在Es細(xì)胞分化肝細(xì)胞中的代謝功能研究 目的：探索分化成熟的肝細(xì)胞若干微粒體Ⅱ相代謝酶的代謝功能，為藥物代謝研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并為肝臟干細(xì)胞治療可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:分化成熟的肝細(xì)胞用細(xì)胞超聲儀破碎后，加入U(xiǎn)GTs特異性底物UDPGA和7-HFC，經(jīng)體外孵育法反應(yīng)，用HPLC法檢測(cè)7-HFC代謝后產(chǎn)物．

10、以此確定UGTs活性；加入mGST1特異性底物CDNB與GSH，以CDNB與GSH結(jié)合形成復(fù)合物的變化測(cè)定分化成熟肝細(xì)胞中mGST1的催化活性。 結(jié)果與結(jié)論：HPLC測(cè)定結(jié)果顯示，ES細(xì)胞UGTs的代謝活性僅為0.069nmol/min/mg，但分化至d 18呈成熟肝細(xì)胞表型時(shí)，UGTs的代謝活性提高到0.445nmol/min/mg，約為未分化ES細(xì)胞的6倍。raGST1的催化活性為7.65nmol/min/mg。提示在ES細(xì)