RabGTPases參與了BLP耐受巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌清除能力增強(qiáng)的過(guò)程.pdf

1、目的：細(xì)菌脂蛋白（bacterial lipoprotein，BLP）是革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中最豐富的蛋白，主要由生長(zhǎng)或裂解的細(xì)菌釋放。研究表明機(jī)體（細(xì)胞）經(jīng)過(guò)小劑量BLP預(yù)處理后，再次給予致死劑量的BLP刺激，機(jī)體（細(xì)胞）表現(xiàn)為炎癥因子釋放減少，死亡率降低，這種現(xiàn)象稱為BLP耐受。BLP耐受是動(dòng)物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種保護(hù)性的機(jī)制，目前，對(duì)這一機(jī)制尚不清楚。在機(jī)體（細(xì)胞）對(duì) BLP的耐受過(guò)程中，突出的表現(xiàn)是機(jī)體（細(xì)胞）對(duì)

2、細(xì)菌的清除能力增強(qiáng)。細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的清除過(guò)程包括吞噬病原微生物和吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體兩部分，其中Rab GTPases是參與吞噬體成熟以及運(yùn)輸病原體這一過(guò)程的重要分子。本課題的目的是探討Rab GTPases是否參與了細(xì)菌脂蛋白（BLP）耐受后骨髓誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞（BMDMs）殺菌能力增強(qiáng)的過(guò)程。
　　方法：選取健康清潔級(jí)體重18-20g的雄性C57BL/6小鼠分離其股骨和脛骨，并獲得骨髓，用L929細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)骨髓

3、中細(xì)胞定向分化成巨噬細(xì)胞，7天成熟后，制備成非耐受組（Naive）組和BLP耐受的BMDMs。接下來(lái)首先用轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白的大腸桿菌（GFP-E.coli）分別感染Naive組和BLP耐受的BMDMs15、30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬了GFP-E.coli的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，觀察細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力；然后用大腸桿菌感染兩組細(xì)胞30、60分鐘，涂板計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，觀察細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺滅能力；其次利用定量PCR比較了BLP耐受BMDMs和Na

4、ive BMDMs中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab14、Rab20、Rab32、Rab34這12種Rab分子的mRNA表達(dá)變化，篩選出水平升高的Rab7以及Rab20分子；接下來(lái)在不同時(shí)間點(diǎn)用熱滅活的大腸桿菌感染Na?ve和BLP耐受的BMDMs，用定量PCR和Western blot證實(shí)Rab7分子以及Rab20分子的mRNA和蛋白表達(dá)在BLP耐受的BMDMs中的

5、變化，發(fā)現(xiàn)高于Na?ve組；最后用RNAi技術(shù)分別下調(diào)BLP耐受巨噬細(xì)胞Rab7分子以及Rab20分子表達(dá)，用轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白的大腸桿菌（GFP-E.coli）分別感染干擾組和非干擾組的細(xì)胞15、30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)吞噬了GFP-E.coli的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，觀察細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力；用大腸桿菌感染干擾組和非干擾組細(xì)胞30、60分鐘，裂解細(xì)胞涂板計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)量，觀察細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺滅能力。
　　結(jié)果：吞菌實(shí)驗(yàn)顯示BLP耐受

6、的BMDMs在15分鐘時(shí)吞噬細(xì)菌數(shù)量（25.7±1.7％）比Na?ve組（13.8±1.7%）顯著增加(P<0.05)，30分鐘時(shí)吞噬細(xì)菌數(shù)量（75.1±0.1%）也比Na?ve組（39.8±5.4%）顯著增加(P<0.05)；殺菌實(shí)驗(yàn)顯示，30分鐘時(shí)，BLP耐受的BMDMs殺滅大腸桿菌的百分比在為Na?ve的1.7倍(P<0.05)，60min時(shí)為Na?ve的1.6倍(P<0.05)；檢測(cè)的12個(gè)Rab分子中，Rab7分子和Rab20

7、分子在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高，Rab7分子在BLP耐受細(xì)胞中是非耐受細(xì)胞的1.4倍(P<0.05)，Rab20在耐受BMDMs中是不耐受的2倍(P<0.05)；進(jìn)一步用定量PCR和Western blot證實(shí)Rab7和Rab20分子的mRNA和蛋白表達(dá)在BLP耐受細(xì)胞感染大腸桿菌后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)均明顯升高；分別下調(diào)Rab7和Rab20的表達(dá)，不影響B(tài)LP耐受巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力；但是下調(diào)Rab7，30分鐘時(shí)非干擾組是

8、干擾組殺菌量的1.6倍(P<0.05)，60分鐘時(shí)非干擾組是干擾組的1.3倍(P<0.05)；下調(diào)Rab20，30、60分鐘時(shí)非干擾組均為干擾組殺菌量的1.3倍(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.BLP耐受后BMDMs清除細(xì)菌的能力增加；
　　2.感染熱滅活的大腸桿菌后，BLP耐受的BMDMs中Rab7和Rab20的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)；
　　3.分別下調(diào)Rab7或Rab20的表達(dá)，BLP耐受的BMDMs對(duì)吞噬能力并