巨噬細(xì)胞EPO-EPOR信號通路促進(jìn)凋亡細(xì)胞清除和免疫耐受.pdf

1、人體由于細(xì)胞分化、發(fā)育、感染、衰老等原因，體內(nèi)每天產(chǎn)生數(shù)以十億計的凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡是一個消耗能量的生物學(xué)過程，如果凋亡細(xì)胞沒有被及時清除，凋亡細(xì)胞會發(fā)生二次壞死。發(fā)生二次壞死的凋亡細(xì)胞不能維持細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致其細(xì)胞膜會破裂從而釋放細(xì)胞內(nèi)容物如自身抗原。正常情況下體內(nèi)的凋亡細(xì)胞能夠被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等專職和非專職吞噬細(xì)胞及時有效地吞噬清除，以防止細(xì)胞內(nèi)自身抗原等內(nèi)容物的釋放和機(jī)體自身免疫應(yīng)答的激活。因而吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)

2、胞的吞噬清除對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是累及皮膚、腎臟、心血管和神經(jīng)等多個組織和器官的慢性自身免疫性疾病。SLE患者外周血中有大量針對自身抗原的自身免疫性抗體如抗核抗體(ANA)和抗DNA抗體(ADA)。研究表明對凋亡細(xì)胞吞噬清除障礙是SLE發(fā)病的重要原因之一，SLE患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬能力較健康人顯著降低，而同時體內(nèi)有大量未被及時吞噬清除的凋亡細(xì)胞積累。
　　凋亡細(xì)胞細(xì)胞能夠

3、釋放“find me”信號分子以有效的募集吞噬細(xì)胞。研究表明凋亡細(xì)胞能夠通過caspase依賴的方式激活鞘氨醇激酶(Sphk)，后者能合成S1P。凋亡細(xì)胞釋放的S1P作為“find me”信號分子，通過巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的S1P受體1(S1PR1)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向凋亡細(xì)胞的定向趨化作用。研究表明在SLE患者外周血單個核細(xì)胞和自發(fā)性紅斑狼瘡Faslpr/lpr小鼠的脾臟中，S1PR1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于正常對照。提示“find

4、me”分子S1P在凋亡細(xì)胞清除和SLE發(fā)病中起著重要作用。除了分泌和釋放“find me”分子，凋亡細(xì)胞表面還提供“eat me”信號分子給巨噬細(xì)胞識別，因而巨噬細(xì)胞能夠識別并吞噬凋亡細(xì)胞而非正常的活細(xì)胞。目前研究最廣泛的“eat me”信號分子是磷脂酰絲氨醇(PS)。PS是細(xì)胞膜的組成成分之一，正常細(xì)胞中PS定位在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)側(cè)面，只有當(dāng)細(xì)胞凋亡時PS才外翻至細(xì)胞膜的外側(cè)面，阻斷凋亡細(xì)胞表面的PS能夠阻斷巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的

5、吞噬。除此之外，巨噬細(xì)胞自身能夠合成分泌某些蛋白分子以識別并結(jié)合PS，例如乳脂肪球表面生長因子8(MFG-E8)和生長停止特異性蛋白6(Gas6)。MFG-E8能夠與PS結(jié)合，并通過整合素介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對PS的識別。血漿中的Gas6能夠結(jié)合凋亡細(xì)胞表面外翻的PS，而與巨噬細(xì)胞上的酪氨酸激酶受體Mer結(jié)合，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對PS的識別與結(jié)合。研究表明，Mfge8缺陷的小鼠出現(xiàn)年齡依賴的SLE自身免疫表型，體內(nèi)產(chǎn)生高濃度的ANA和ADA，而M

6、er缺陷的小鼠也會出現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣的自身免疫性癥狀。這些結(jié)果均說明凋亡細(xì)胞吞噬清除障礙是機(jī)體自身免疫性疾病的重要原因之一。
　　激素類糖蛋白分子促紅細(xì)胞生成素(EPO)是促進(jìn)機(jī)體造血過程的重要調(diào)控因子。EPO下調(diào)紅細(xì)胞前體細(xì)胞上的FasL/Fas表達(dá)而抑制未成熟紅細(xì)胞的凋亡，增加外周血成熟紅細(xì)胞的數(shù)量促進(jìn)機(jī)體造血功能。最近的研究表明，EPO還具有炎癥調(diào)控功能。在我們之前的報道中EPO能夠抑制大鼠實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的炎癥因子

7、表達(dá)和炎癥細(xì)胞的浸潤，具有顯著的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)并且是EPO調(diào)控炎癥的重要靶細(xì)胞。EPO能夠通過抑制巨噬細(xì)胞在LPS和IFN-γ等炎癥刺激下NF-κB的活化而抑制TNF-α，IL-6和IL-12等促炎因子的表達(dá)與釋放。此外研究發(fā)現(xiàn)EPO能夠促進(jìn)人外周血單核巨噬細(xì)胞對細(xì)菌和顆粒物的吞噬。在小鼠模型中，向野生型C57BL/6小鼠腹腔注射EPO后其腹腔巨噬細(xì)胞對細(xì)菌和顆粒物的吞噬率顯著增加。在EPO

8、過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因tg6小鼠中研究也發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細(xì)胞對細(xì)菌和顆粒物的吞噬顯著高于野生型小鼠。在tg6小鼠中進(jìn)一步研究表明tg6小鼠巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的吞噬能力顯著高于野生型小鼠，而巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的吞噬機(jī)制與凋亡細(xì)胞吞噬類似，都是PS外翻、Mer介導(dǎo)的吞噬過程，因而上述結(jié)果提示EPO能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬作用。
　　臨床研究提示SLE患者中EPO/EPOR信號通路的功能障礙與SLE疾病嚴(yán)重度有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血

9、中EPO的濃度顯著低于健康人，46％的SLE患者外周血中檢出抗EPO抗體，且抗EPO抗體陽性的SLE患者其體內(nèi)抗雙鏈DNA滴度顯著高于抗EPO抗體陰性的SLE患者，提示SLE病人中EPO信號通路的功能不足與SLE自身免疫性反應(yīng)的潛在關(guān)聯(lián)。除了抗EPO抗體，研究發(fā)現(xiàn)SLE患者中還存在抗EPOR抗體，抗EPOR抗體陽性的SLE患者其抗雙鏈DNA抗體和疾病活動度均較高。另一研究證實SLE患者血清中的抗EPOR自身抗體能夠中和體內(nèi)EPO活性。上

10、述臨床研究結(jié)果均提示SLE患者體內(nèi)EPO/EPOR信號通路功能障礙，且抗EPO/EPOR抗體與患者自身免疫性嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
　　我們的研究表明，凋亡細(xì)胞釋放的“find me”分子S1P能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞EPO/EPOR通路的表達(dá)和活化。EPO/EPOR通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ的表達(dá)促進(jìn)其對凋亡細(xì)胞的吞噬。巨噬細(xì)胞EPOR條件性敲除后對凋亡細(xì)胞的吞噬顯著降低，相應(yīng)的EPOR-cKO小鼠出現(xiàn)年齡依賴的凋亡細(xì)胞累積和系統(tǒng)性自身免疫

11、性癥狀，具體而言我們做了以下工作。
　　在第一部分的研究中，體外實驗發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞條件化培養(yǎng)基和S1P誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞HIF-1α、EPO、EPOR和p-Jak2的表達(dá)，而缺乏S1P的凋亡細(xì)胞條件化培養(yǎng)基不具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞EPO/EPOR通路表達(dá)的作用，阻斷巨噬細(xì)胞S1PR1能夠抑制凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基和S1P的上述作用。體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)注射外源性凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基和S1P體內(nèi)通過S1PR1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞EPO/EPOR信號通路的表達(dá)以及活化

12、。使用注射地塞米松誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡能夠在體內(nèi)通過S1PR1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞EPO/EPOR信號通路的表達(dá)以及活化。生理條件下阻斷S1PR1或阻斷細(xì)胞凋亡后小鼠脾臟EPO水平和脾臟巨噬細(xì)胞EPOR的表達(dá)均顯著降低。以上結(jié)果表明凋亡細(xì)胞釋放的S1P通過S1PR1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞EPO/EPOR通路的表達(dá)和活化。
　　第二部分我們研究了EPO/EPOR通路對巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的調(diào)控作用。體外研究結(jié)果表明，EPOR敲除后小鼠巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞

13、的吞噬顯著降低，而外源性rhEPO促進(jìn)巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬。體內(nèi)注射凋亡細(xì)胞后檢測發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞條件性EPOR敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的體內(nèi)吞噬顯著降低，而外源性rhEPO促進(jìn)WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脾臟巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬。生理條件下EPOR-cKO小鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的比例顯著低于野生型小鼠。以上結(jié)果證明EPO/EPOR通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的調(diào)控作用。炎癥因子檢測發(fā)現(xiàn)rhEPO抑制巨噬細(xì)胞TN

14、F-α，IL-6，MCP-1的分泌，促進(jìn)TGF-β分泌，而EPOR-KO腹腔巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后分泌較多TNF-α，IL-6，MCP-1和較少的TGF-β。我們在55周齡的老年EPOR敲除小鼠脾臟、外周血、胸腺、腎臟等組織中觀察到凋亡細(xì)胞的積累顯著增加，進(jìn)一步表明EPOR-cKO小鼠中巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬清除能力是下降的。
　　第三部分研究結(jié)果顯示rhEPO能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ的表達(dá)水平，EPOR-cKO小鼠腹腔巨

15、噬細(xì)胞PPARγ的表達(dá)顯著降低。rhEPO不能促進(jìn)PPARγ-cKO小鼠巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬，而PPARγ激動劑能夠促進(jìn)EPOR-cKO小鼠巨噬細(xì)胞巨噬凋亡細(xì)胞，表明rhEPO促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞通過PPARγ途徑。此外研究發(fā)現(xiàn)rhEPO能夠誘導(dǎo)野生型小鼠巨噬細(xì)胞而非PPARγ缺陷巨噬細(xì)胞Mfge8，Mertk，CD36和Gas6等與吞噬凋亡細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)一步表明EPO通過上調(diào)PPARγ促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞。

16、　　第四部分研究結(jié)果表明凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基中的S1P能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ表達(dá)顯著增加，S1P和凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)野生型小鼠巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬，而不能促進(jìn)EPOR-cKO和PPARγ-cKO小鼠巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞。S1P能誘導(dǎo)野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Mfge8，Mertk，CD36和Gas6的表達(dá)，而不能誘導(dǎo)EPOR-cKO小鼠巨噬細(xì)胞上述分子表達(dá)的增加，進(jìn)一步表明S1P通過EPO/EPOR促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞。
　

17、　第五部分我們研究EPOR-cKO小鼠年齡依賴的SLE樣自身免疫性改變。研究發(fā)現(xiàn)40和55周齡EPOR-cKO小鼠血清抗雙鏈DNA，抗核抗體，抗Sm抗體顯著高于對照。55周齡EPOR-cKO小鼠腎臟沉積大量的IgG、IgA和C3，同時出現(xiàn)蛋白尿等腎功能受損的特征。此外在55周齡的EPOR-cKO小鼠皮膚中出現(xiàn)明顯的IgG沉積，肺部B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤顯著，外周血促炎因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IFN-α和IFN-β與野生型小鼠

18、相比顯著增加，而炎癥抑制因子TGF-β表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明EPOR-cKO小鼠出現(xiàn)年齡依賴的SLE樣自身免疫性疾病。
　　綜上所述，我們的研究表明凋亡細(xì)胞釋放的S1P通過S1PR1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞HIF-1α表達(dá)，HIF-1α進(jìn)一步誘導(dǎo)EPO/EPOR通路的表達(dá)與活化。EPO/EPOR通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ表達(dá)從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬。在EPOR-cKO小鼠中，EPOR敲除的巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞能力降低，小鼠出現(xiàn)年齡