天然免疫細(xì)胞參與HBV耐受以及HBV誘導(dǎo)肝癌的機(jī)制研究.pdf

1、肝臟作為重要的代謝器官，廣泛參與糖代謝，蛋白質(zhì)代謝以及脂類代謝。肝臟同時也是一個重要的免疫器官，富含大量天然樣免疫細(xì)胞以及獲得樣免疫細(xì)胞，其在自免疫性炎癥，微生物感染以及腫瘤的免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮著重要的作用。由于肝臟具備天然免疫優(yōu)勢狀態(tài)，同時富含大量的調(diào)節(jié)性細(xì)胞以及獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，容易在肝臟引發(fā)全身耐受，因而肝臟又是一個重要的耐受器官。
　　嗜肝病毒感染，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染肝臟后，容易

2、誘發(fā)肝臟耐受，形成慢性HBV感染(Chronic Hepatitis B，CHB)。病毒特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答對于病毒的清除至關(guān)重要，但是在CHB患者肝臟以及外周血中，病毒特異性T細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生耗竭甚至克隆丟失，從而失去抗病毒能力，使得病毒抗原在肝臟中持續(xù)性表達(dá)。天然免疫系統(tǒng)對調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)能力，在病毒感染過程中，天然免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱以及持續(xù)時間對于病毒特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答或者抗體產(chǎn)生息息相關(guān)，比如樹突狀細(xì)胞

3、(dendritic cell，DC)，macrophage等呈遞抗原的能力，又比如NK細(xì)胞，Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2促進(jìn)CD8+T細(xì)胞存活和擴(kuò)增等。在本文中我們著重研究了γδT細(xì)胞—一類重要的天然樣免疫細(xì)胞—在HBV耐受過程中的作用，我們的結(jié)果表明其似乎更像是發(fā)揮著旁觀者效用。
　　慢性HBV感染與肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的發(fā)生密切相關(guān)。我國目前每年約有30萬人死于肝臟腫瘤，其中絕大部分

4、為慢性HBV攜帶者。HBV感染肝細(xì)胞后，基因組發(fā)生的隨機(jī)插入以及HBx蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞惡性化密切相關(guān)。同時HBV病理學(xué)進(jìn)程表明，當(dāng)肝臟中HBV病毒復(fù)制活躍，這時期可觀察到顯著的肝臟炎癥，這類HBV攜帶者更容易發(fā)生肝細(xì)胞癌變，暗示肝臟慢性炎癥對于HCC的發(fā)生密切相關(guān)，這也與目前廣泛接受的慢炎誘癌學(xué)說不謀而合。因而研究HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌為臨床治療提供了新的理論依據(jù)。本文將闡釋在原發(fā)性肝臟腫瘤發(fā)生過程慢性炎癥發(fā)揮著重要的作用。
　　

5、本文取得的主要結(jié)果從以下兩個方面概述。
　　Ⅰ、γδT細(xì)胞調(diào)節(jié)肝臟免疫耐受的研究本研究采取pAAV/HBV1.2以及rAAV/HBV1.3病毒注射構(gòu)建了HBV攜帶小鼠，WTHBV攜帶小鼠可檢測到肝實(shí)質(zhì)中病毒抗原的表達(dá)，并且分泌到胞外在血清中可以檢測到高濃度的HBsAg，HBeAg，HBV-DNA等表達(dá)，同時肝臟幾乎沒有炎癥，抗原特異性體液免疫應(yīng)答以及T細(xì)胞免疫應(yīng)答均受損;因而該模型模擬了人群中的慢性HBV攜帶者免疫耐受期的狀態(tài)。<

6、br>　　首先我們檢測到HBV耐受小鼠中γδT細(xì)胞的總數(shù)尤其是Vγ4細(xì)胞亞群發(fā)生了顯著的上調(diào)。進(jìn)一步我們采取TCRδ-/-小鼠觀察到HBV耐受不能形成，血清中HBV抗原以及肝臟表達(dá)的HBc抗原明顯下降直至消失。采用Anti-γδTCR清除HBV攜帶小鼠全身γδT細(xì)胞也獲得了類似的結(jié)果;進(jìn)一步我們分選出γδT細(xì)胞轉(zhuǎn)輸TCRδ-/-小鼠后，HBV耐受恢復(fù)，因此表明，γδT細(xì)胞對于HBV耐受的形成至關(guān)重要。
　　接下來我們檢測發(fā)現(xiàn)TCR

7、δ-/-小鼠相比WT小鼠，肝臟HBV特異性體液免疫應(yīng)答沒有差異，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞比例也沒有差異;非常有意思的是肝臟的HBV特異性CD8+T細(xì)胞比例以及功能均發(fā)生了顯著的上升;表征CD8+T細(xì)胞的耗竭被逆轉(zhuǎn)。
　　進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞對于CD8+T細(xì)胞的耗竭發(fā)揮著旁觀者效應(yīng)。持續(xù)性表達(dá)的HBV抗原對于γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17進(jìn)而招募髓系來源抑制細(xì)胞(MDSC)進(jìn)入肝臟至關(guān)重要。MDSC繼而通過產(chǎn)生iNOS以及ar

8、ginase-1直接抑制了CD8+T細(xì)胞的活化。在IL-17-/-小鼠中，我們也觀察到MDSC顯著減少，同時CD8+T細(xì)胞功能恢復(fù)，并且HBV耐受不能形成。體內(nèi)抑制arginase-1亦顯著改善CD8+T細(xì)胞功能并且加速HBV排斥。
　　綜上所述;γδT細(xì)胞作為一種天然樣T細(xì)胞，在HBV耐受的形成過程中起始了MDSC的肝臟聚集，誘使CD8+T細(xì)胞發(fā)生功能耗竭而導(dǎo)致肝臟耐受。靶向這一過程能顯著改善HBV特異性T細(xì)胞功能，促進(jìn)HBV的

9、排斥。
　?、?、NK細(xì)胞抵抗CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌的研究本研究采取HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型，由于該小鼠具備輕微自發(fā)炎癥且自然發(fā)生肝臟腫瘤，很好的模擬了臨床上HBV患者高發(fā)肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)的現(xiàn)象。為了驗(yàn)證慢性炎癥誘發(fā)腫瘤，我們采取連續(xù)CCl4注射誘導(dǎo)肝臟持續(xù)性炎癥，觀察到在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中約6個月即發(fā)生肝臟腫瘤，表明慢性炎癥確實(shí)促進(jìn)了肝臟腫瘤的發(fā)生。
　　進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)CCl4誘

10、導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟炎癥的同時，伴隨著肝臟上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生，EMT被認(rèn)為是腫瘤生長以及遷移的重要機(jī)制。同時我們注意到肝臟NK細(xì)胞活化性分子下調(diào)，抑制性分子上調(diào)，表明NK細(xì)胞受到抑制。進(jìn)一步我們觀察到清除NK細(xì)胞后，肝臟EMT標(biāo)志蛋白vimentin表達(dá)顯著上調(diào)。清除NK細(xì)胞后可觀察到慢性炎癥誘導(dǎo)的肝臟腫瘤顯著增多;表明NK在該過程中發(fā)揮著免疫監(jiān)視功能。采取PloyⅠ∶C活化NK細(xì)胞，可顯著減少CCl4誘導(dǎo)的肝臟腫瘤的發(fā)生。

11、
　　此外，我們慢炎誘癌的模型還可以用于肝臟腫瘤的治療和預(yù)防研究。比如由于免疫細(xì)胞可能介導(dǎo)了肝臟炎癥，因而采取了免疫抑制劑處理，觀察到抑制免疫細(xì)胞后，肝臟腫瘤生長更快;而采取非甾體類抗炎藥處理，我們觀察到一定的抑癌效果。非常有意思的是，PolyⅠ∶C處理HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后可以顯著預(yù)防肝臟腫瘤的發(fā)生。
　　綜上所述，我們構(gòu)建了一個非常實(shí)用的慢性炎癥誘導(dǎo)肝臟腫瘤模型，并且觀察到NK細(xì)胞通過靶向抑制EMT發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。采用非甾