一對(duì)同卵雙生個(gè)體DNA甲基化譜差異的研究.pdf

1、目的:DNA甲基化是指在基因組DNA中胞嘧啶第5位碳原子發(fā)生甲基共價(jià)修飾,其主要發(fā)生在CpG二核苷酸。作為表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一,它在調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化增殖、人體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。同卵雙生子(monozygotic twins,MZ)是由一個(gè)受精卵在內(nèi)在和外在因素的共同作用下,發(fā)育為兩個(gè)完全獨(dú)立的個(gè)體,因此同卵雙生兩個(gè)體的遺傳背景完全相同,享有共同的DNA序列。在法醫(yī)DNA分析領(lǐng)域,現(xiàn)有的DNA遺傳分析系統(tǒng)理論上可以識(shí)別除同卵

2、雙生子外的所有個(gè)體。然而,對(duì)于遺傳DNA序列完全相同的同卵雙生個(gè)體,現(xiàn)有的DNA分析手段尚不能有效鑒別。目前,眾多對(duì)于同卵雙生子表觀遺傳學(xué)的研究都己證實(shí),同卵雙生子無(wú)論在整個(gè)表觀遺傳組水平還是對(duì)于特異位點(diǎn)都存在著表觀遺傳的差異,而且每一個(gè)體的表觀遺傳水平在生命的每個(gè)階段也是呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。本研究采用甲基化免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序的方法(methylatedDNA immunoprecipitation sequencing,MeD

3、IP-seq),探索在新生兒同卵雙生子的DNA甲基化譜分布特點(diǎn)及其之間的差異,并且尋找到若干普遍存在的差異位點(diǎn),為在表觀遺傳水平建立同卵雙生子識(shí)別系統(tǒng)提供基礎(chǔ)。
　　 方法:收集5對(duì)雙胞胎新生兒臍帶血,應(yīng)用DP-318血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取血液基因組DNA,用Identifiler(R)試劑盒檢測(cè)15個(gè)常染色體STR基因座分型,選擇分型完全相同的1對(duì)同卵雙生子DNA樣本,應(yīng)用MeDIP-seq方法

4、進(jìn)行甲基化譜分析。首先用超聲將DNA隨機(jī)打斷至100～500bp,進(jìn)行DNA末端修復(fù),3’末端加上“A”堿基及測(cè)序接頭;然后將雙鏈DNA變性為單鏈,用5-Mc抗體沉淀,MeDIP沉淀產(chǎn)物進(jìn)行Qpcr驗(yàn)證,隨后進(jìn)行純化及擴(kuò)增,選擇200-300bp的片段進(jìn)行TA克隆、SOLEXA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參考基因組比對(duì),可唯一比對(duì)的序列用于后續(xù)的信息分析,包括reads統(tǒng)計(jì)與分布,MeDIP-seq序列富集區(qū)域(peak)的信息分析,peak水平

5、的差異分析,peak區(qū)域基因本體(geneontology,GO)分析。根據(jù)分析結(jié)果,從中選擇適合于法醫(yī)DNA分析的DNA甲基化差異位點(diǎn),作為后續(xù)研究的候選位點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1基本生物信息分析:對(duì)于此對(duì)同卵雙胞胎的MeDIP測(cè)序,各獲得3.6G數(shù)據(jù),包含有73,469,388條reads,每條reads讀長(zhǎng)為49bp。將這些reads與參考基因組比對(duì),兩樣本分別獲得65,207,711條和65,579,985條

6、reads,分別占總reads的88.75％和89.26％,其中可唯一比對(duì)的reads分別為48,754,692和50,069,020條,分別占可比對(duì)數(shù)目的74.77％和76.35％?；蚪M覆蓋率分別為33.25％和38.76％,覆蓋深度分別為3.22和2.76。統(tǒng)計(jì)可唯一比對(duì)reads在基因各功能元件分布,發(fā)現(xiàn)在各功能元件均有分布但分布不均,以重復(fù)區(qū)域分布最多。統(tǒng)計(jì)在各重復(fù)區(qū)域的分布,發(fā)現(xiàn)在多個(gè)重復(fù)區(qū)域均有分布,然而在短散在重復(fù)序列/

7、Alu序列分布最多。
　　 2 MeDIP-seq序列富集區(qū)域(Peak)信息分析:統(tǒng)計(jì)可唯一比對(duì)reads的富集區(qū)域(peak),各得到257,362條和197,272條peak,基因組覆蓋率達(dá)到6.53％和5.29％。統(tǒng)計(jì)這些peak在各長(zhǎng)度區(qū)間的分布,發(fā)現(xiàn)兩樣本均在600～700bp長(zhǎng)度區(qū)間擁有最多的peak,并且雖然在各長(zhǎng)度區(qū)間分布趨勢(shì)相似,然而數(shù)目卻有所不同。統(tǒng)計(jì)peak在各基因功能元件分布,發(fā)現(xiàn)peak在各基因功能元

8、件的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩樣本在各元件均有分布,但均以internalintrons分布最多。對(duì)這些peak相關(guān)基因進(jìn)行GO功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)在GO的三項(xiàng)功能條目中均有分布但分布不均。
　　 3 DNA甲基化差異序列分析:在基因相關(guān)區(qū)域統(tǒng)計(jì)兩樣本間差異基因功能元件,共得到477個(gè)差異基因功能元件。對(duì)這些尋找到的基因功能元件進(jìn)行GO功能富集發(fā)現(xiàn)這些差異基因在GO的三個(gè)分支中均有分布,只是分布水平不同。在全基因組范圍內(nèi)尋找具有顯著差異的區(qū)域,共

9、找到2205條存在DNA甲基化差異的序列,其中595條位于基因區(qū)域,1610條位于基因間區(qū)。從這些差異片段中,我們最終選出113個(gè)片段作為后續(xù)分析的候選位占
　　 結(jié)論:
　　 1本研究首次應(yīng)用MeDIP-seq的方法檢測(cè)一對(duì)新生兒同卵雙生個(gè)體DNA甲基化譜系特征,并進(jìn)行差異位點(diǎn)的篩選,找到2205條存在DNA甲基化差異的序列,其中595條位于基因區(qū)域,1610條位于基因間區(qū)。
　　 2初步證實(shí)了DNA甲基化鑒別