PPAR-α-HO-1信號通路在HepG2細(xì)胞脂肪變性中的變化.pdf

1、目的：
　　 研究PPAR-α/HO-1信號通路在肝細(xì)胞脂肪變性中的變化，探討其在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的可能作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞株，以油酸(OA)誘導(dǎo)其脂肪變性，建立NAFLD細(xì)胞模型，采用不同濃度的PPAR-α激動劑非諾貝特（fenofibrate，F(xiàn)F）及抑制劑MK-886（10μmol/L）處理人肝癌HepG2細(xì)胞，將細(xì)胞分為6組：
　　 (1)對照組；

2、
　　 (2)模型組：OA0.2mmol/L;
　　 (3)5μmol/L的FF模型組：OA0.2mmol/L+FF5μmol/L;
　　 (4)10μmol/L的FF模型組：OA0.2mmol/L+FF10μmol/L;
　　 (5)50μmol/L的FF模型組：OA0.2mmol/L+FF50μmol/L;
　　 (6)10μmol/L的MK-886模型組：OA0.2mmol/L+FF10μm

3、ol/L+MK-886100μmol/L。
　　 MTT法檢測細(xì)胞相對活性并制作細(xì)胞生長曲線，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量，甘油-3-磷酸氧化酶法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量，化學(xué)比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測各組HepG2細(xì)胞PPAR-α、HO-1 mRNA水平，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測PPAR-α與HO-1蛋白表達(dá)。
　　

4、 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞生長曲線及油紅O染色結(jié)果：細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，OA濃度≤0.2mM，HepG2細(xì)胞增殖活力不受影響，OA濃度＞0.2mM，隨OA濃度的增加HepG2細(xì)胞增殖活力逐漸下降。油紅O染色結(jié)果顯示，OA濃度對照組細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞內(nèi)未見明顯橘紅色脂滴，誘導(dǎo)24h的HepG2細(xì)胞油紅O染色見細(xì)胞內(nèi)充滿大小不等的橘紅色脂肪滴，甚至融合，形成明顯的細(xì)胞脂變特點。FF干預(yù)組與模型組相比，隨FF濃度增高，細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸

5、變小，數(shù)量減少，PPAR-α抑制劑MK-886作用組細(xì)胞內(nèi)有明顯脂滴，呈現(xiàn)橘紅色，與模型組無明顯差異。
　　 2、細(xì)胞內(nèi)TG檢測結(jié)果：模型組與對照組相比，TG含量顯著增高(P＜0.01);FF干預(yù)組與模型組相比，TG含量均明顯降低(P＜0.01)，且下降程度呈FF濃度依賴性，MK-886作用組TG含量與模型組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)上清液MDA及SOD檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)

6、上清液MDA含量明顯升高P＜0.01），SOD活性明顯降低(P＜0.01)。FF干預(yù)組與模型組相比，隨FF濃度增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液MDA含量逐漸降低(P＜O.01)，SOD活性逐漸升高P＜0.01），且具有濃度依賴性，等摩爾濃度的MK-886明顯阻斷FF的激動作用，MDA含量及SOD活性與模型組相比無明顯差異P＞0.05）。
　　 4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示：正常HepG2細(xì)胞中PPAR-α及HO-1mRNA表達(dá)水平較高，而模

7、型組PPAR-α和HO-1 mRNA的表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，同時，F(xiàn)F干預(yù)組與模型組相比，PPAR-α與HO-1 mRNA的表達(dá)水平同步升高（P＜0.01），二者呈正相關(guān)(r=0.993)，且均呈現(xiàn)FF濃度依賴性，MK-88610μmol/L可完全取消FF的作用，PPAR-α與HO-1 mRNA的表達(dá)水平與模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 5、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：在正常HepG2細(xì)胞PPAR-α主要在細(xì)

8、胞核表達(dá)，HO-1以胞漿表達(dá)為主，顯色呈現(xiàn)明顯的棕色顆粒沉積。圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組PPAR-α蛋白與HO-1蛋白的表達(dá)量明顯下降，與模型組相比，隨著FF干預(yù)濃度增加，PPAR-α與HO-1蛋白的表達(dá)均升高（F直分別為139.201，126.733，P＜O.01），二者呈正相關(guān)(r=0.997)，并呈現(xiàn)FF濃度依賴性，MK-886作用組PPAR-α與HO-1蛋白的表達(dá)與模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。