具有潛在治療阿爾茨海默病作用的3種中藥成分的藥效學(xué)觀察及其機(jī)制研究.pdf

1、本課題研究內(nèi)容主要包括二個(gè)部分:1.三種中藥成分在轉(zhuǎn)基因模型鼠體內(nèi)抑制Aβ斑塊的藥效學(xué)作用;2.三種中藥成分在體外抑制Aβ的作用途徑及其相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分:三種中藥成分對AD轉(zhuǎn)基因模型鼠體內(nèi)的藥效學(xué)作用的研究
　　目的:研究3種中藥成分(天麻素(GAS)、黃芪總皂苷(AST)、芍藥苷（PAE））對AD轉(zhuǎn)基因模型5XFAD鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知和記憶能力的影響和抑制腦內(nèi)Aβ斑塊的效果，并觀察3種中藥成分的干預(yù)是否對小鼠的生長發(fā)育有影

2、響。
　　方法:選用1.5月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠，隨機(jī)分為7組，另取同窩陰性小鼠作為正常對照，每組10只。(1)陽性對照組(Tg):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予不含藥物的生理鹽水;(2)陰性對照組(Control):同窩陰性小鼠給予不含藥物的生理鹽水;(3)天麻素高劑量組(GAS-H):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含300mg/kg/d天麻素的生理鹽水(4)天麻素低劑量組(GAS-L):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含150mg/kg/d天麻素的生

3、理鹽水(5)黃芪總皂苷高劑量組(AST-H):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含160mg/kg/d黃芪總皂苷的生理鹽水(6)黃芪總皂苷低劑量組(AST-L):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含80mg/kg/d黃芪總皂苷的生理鹽水(7)芍藥苷高劑量組（PAE-H）:轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含60mg/kg/d芍藥苷的生理鹽水(8)芍藥苷低劑量組(PAE-L):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠給予含30mg/kg/d芍藥苷的生理鹽水。每周測量各組小鼠體重及監(jiān)測小鼠的日均飲水量，按照體重及

4、日均飲水量調(diào)整給藥劑量。給藥4個(gè)月后，通過Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力的變化;免疫組織化學(xué)染色法觀察腦組織內(nèi)Aβ斑塊的變化;ELISA法檢測小鼠腦組織勻漿中Aβ含量的水平;另外為評價(jià)藥物對小鼠的是否具有肝腎毒副作用，ELISA法檢測小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐的變化及小鼠腦組織勻漿中IFN-γ和IL-4水平的變化。
　　結(jié)果:1.Morris水迷宮結(jié)果顯示，與陽性對照組(Tg)組相比，用藥各組小

5、鼠平臺(tái)尋找時(shí)間明顯縮短，在原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長:第5天時(shí)，天麻素高劑量組(GAS-H)和低劑量組(GAS-L)平臺(tái)尋找時(shí)間分別縮短83.66％和46.72％(P＜0.01);，黃芪總皂苷高劑量組(AST-H)和低劑量組(AST-L)平臺(tái)尋找時(shí)間分別縮短41.60％和23.78％(P＜0.01);芍藥苷高劑量組（PAE-H）和低劑量組(PAE-L)平臺(tái)尋找時(shí)間分別縮短48.23％和29.31％(P＜0.01);天麻素高劑量組(GAS

6、-H)和低劑量組(GAS-L)在原目標(biāo)象限停留時(shí)間分別延長2.28倍和1.83倍;黃芪總皂苷高劑量組(AST-H)和低劑量組(AST-L)在原目標(biāo)象限停留時(shí)間分別延長1.88倍和1.38倍(P＜0.01);芍藥苷高劑量組（PAE-H）和低劑量組（PAE-L）在原目標(biāo)象限停留時(shí)間分別延長1.83倍和1.62倍(P＜0.01)。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示:5XFAD鼠的Tg組腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)區(qū)可見明顯的大小不一、棕黃色的Aβ斑塊沉積，呈

7、彌漫分布。GAS和AST及PAE各組與Tg組相比，腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)區(qū)Aβ斑塊呈散在分布，斑塊體積和數(shù)目顯著減少、染色變淺。Control組腦內(nèi)未見Aβ斑塊。IPP軟件分析結(jié)果顯示:與陽性對照組相比，3種中藥成分均能夠降低模型小鼠腦部海馬區(qū)和皮層區(qū)Aβ斑塊陽性面積。在海馬區(qū)，天麻素高劑量組(GAS-H)陽性面積降低最為顯著達(dá)70.13％;天麻素低劑量組(GAS-L)降低達(dá)39.25％(P＜0.01);黃芪高劑量組(AST-H)和黃芪低劑量組

8、(AST-L) Aβ斑塊陽性面積分別降低62.39％和31.51％(P＜0.05);芍藥苷高劑量組(PAE-H)和芍藥苷低劑量組(PAE-L) Aβ斑塊陽性面積分別降低57.58％和30.52％(P＜0.05)。在皮層區(qū)，天麻素高劑量組(GAS-H)降低最為顯著達(dá)80.96％;天麻素低劑量組(GAS-L)降低達(dá)36.67％;黃芪高劑量組(AST-H)和黃芪低劑量組(AST-L) Aβ斑塊陽性面積分別降低69.57％和37.90％(P＜0

9、.01);芍藥苷高劑量組(PAE-H)和芍藥苷低劑量組(PAE-L) Aβ斑塊陽性面積分別降低66.62％和27.62％(P＜0.05)。
　　3.ELISA檢測小鼠腦勻漿中Aβ含量的結(jié)果顯示，與Tg組腦勻漿Aβ的平均OD值相比，AST、GAS和PAE各組均有不同程度降低。其中，天麻素高劑量組(GAS-H)降低效果最為顯著達(dá)62.18％;天麻素低劑量組(GAS-L)降低達(dá)35.94％;黃芪高劑量組(AST-H)和黃芪低劑量組(AS

10、T-L)小鼠腦勻漿中Aβ分別降低51.58％和24.07％(P＜0.01);芍藥苷高劑量組(PAE-H)和芍藥苷低劑量組(PAE-L)小鼠腦勻漿中Aβ分別降低51.02％和14.16％(P＜0.05)。
　　4.ELISA法檢測小鼠腦組織勻漿中細(xì)胞因子水平的變化的結(jié)果顯示，用藥各組小鼠（天麻組小鼠、黃芪總皂苷組小鼠及芍藥苷組小鼠）與陽性對照組小鼠相比，其腦組織勻漿中IFN-γ和IL-4的含量均無明顯變化(P＞0.05)。
　

11、　5.ELISA法檢測小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐的結(jié)果顯示，用藥各組小鼠（天麻組小鼠、黃芪總皂苷組小鼠及芍藥苷小鼠）與陽性對照組小鼠相比，其血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐的含量均無明顯變化(P＞0.05)。
　　6.測量各組小鼠的體重變化的結(jié)果顯示，在不同的時(shí)間點(diǎn)（1，2，3，4月），陰性對照小鼠，陽性對照小鼠及用藥各組小鼠的體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)。
　　第二部分:三種中藥成分抑制模型細(xì)胞中Aβ的作用

12、途徑及相關(guān)機(jī)制的研究
　　目的:利用雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型117細(xì)胞（過表達(dá)Aβ和β-分泌酶）和146細(xì)胞（過表達(dá)Aβ和γ-分泌酶），研究三種中藥成分天麻素、黃芪總皂苷和芍藥苷抑制Aβ的作用機(jī)制。
　　方法:天麻素、黃芪總皂苷和芍藥苷以不同的濃度(10、25、50、100μmol·L-1)作用于117模型細(xì)胞和146細(xì)胞，ELISA雙抗夾心法分別檢測細(xì)胞內(nèi)外Aβ含量變化，Q-PCR法檢測117細(xì)胞BACEmRNA和146細(xì)胞PS

13、1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Wsetern-blot法檢測β-分泌酶和γ-分泌酶蛋白水平的變化。同時(shí)，CCK-8試劑盒檢測三種中藥成分對細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:1.ELISA法檢測結(jié)果顯示，與未干預(yù)對照組相比，三種中藥成分天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷對117細(xì)胞模型和146細(xì)胞模型內(nèi)外Aβ水平均有降低，且降低效果呈藥物濃度依賴性。天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷抑制117細(xì)胞內(nèi)Aβ最高分別達(dá)69.2％、64.8％

14、和47.9％（P＜0.01），抑制117細(xì)胞外Aβ最高分別達(dá)65.8％、67.8％和25.2％(P＜0.05);天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷抑制146細(xì)胞內(nèi)Aβ最高分別達(dá)67.9％、82.6％和49.9％(P＜0.01)，天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷抑制146細(xì)胞外Aβ最高分別達(dá)67.1％、65.4％和50.9％（P＜0.01）。
　　2.Q-PCR檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天麻素對117細(xì)胞β-分泌酶轉(zhuǎn)錄水平有降低作用。與天麻素未干預(yù)對照組

15、相比，經(jīng)天麻素處理24 h的117細(xì)胞，BACEmRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，且降低效果呈濃度依賴性。其中，25μmol·L-1天麻素劑量組降低22.8％，50和100μmol·L-1天麻素劑量組分別降低30.7％和32.9％(P＜0.01)。未觀察到芍藥苷、黃芪總皂苷對117細(xì)胞BACE mRNA轉(zhuǎn)錄水平有影響;天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷三種中藥成分對146細(xì)胞內(nèi)γ-分泌酶轉(zhuǎn)錄水平均無影響。
　　3.Western Blotting檢測

16、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天麻素在25、50、100μmol·L-1濃度均可降低-分泌酶蛋白的表達(dá)，且在50μ mol·L-1時(shí)降低最明顯為47.9％(P＜0.01)。黃芪總皂苷、芍藥苷均對β-分泌酶蛋白的表達(dá)無影響。天麻素、黃芪總皂苷、芍藥苷均對γ-分泌酶蛋白表達(dá)均無影響。
　　4.CCK-8法測定結(jié)果均顯示，天麻素、黃芪總皂苷和芍藥苷各自干預(yù)117細(xì)胞和146細(xì)胞24h后，各藥物干預(yù)組細(xì)胞活性相對于未干預(yù)對照組無明顯變化;且流式細(xì)胞術(shù)檢測

17、結(jié)果顯示，天麻素、黃芪總皂苷和芍藥苷干預(yù)117細(xì)胞24h后，各干預(yù)組的凋亡率與未干預(yù)組相比，未有差異變化。
　　總結(jié):長期以來對中藥治療AD是否具有特異性或特效性，如有特異性其作用途徑和作用機(jī)制是什么，一直都不清楚。本課題在這方面做了探索研究，初步結(jié)果顯示天麻素、黃芪總皂苷和芍藥苷對AD的治療均具有特異性，其作用途徑是通過抑制Aβ產(chǎn)生并減少Aβ斑塊形成，進(jìn)而減少老年斑對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，抑制AD的病程發(fā)展。其中天麻素的作用最顯著