牙鲆甲狀腺激素受體TRαA的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、牙鲆是鰈形目魚類中一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。在其早期發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)歷一從仔魚到稚魚的變態(tài)發(fā)育過(guò)程，最典型的變態(tài)現(xiàn)象是右眼向身體左側(cè)遷移，從而使兩只眼睛同時(shí)位于身體的一側(cè)。伴隨著右眼移位，仔魚在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能和行為方式等方面都發(fā)生了變化，其頭部腦顱骨骼也發(fā)生巨大的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為左右（L/R）不對(duì)稱。脊椎動(dòng)物分泌合成兩種亞型的甲狀腺激素（THs）：三碘甲腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4），其在哺乳動(dòng)物、兩棲類的早期發(fā)育和變態(tài)中發(fā)

2、揮重要的作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)THs在鰈形目魚類的變態(tài)發(fā)育中同樣起著非常重要的作用。研究表明甲狀腺激素在牙鲆變態(tài)發(fā)育中起著核心作用，THs主要通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、新陳代謝的調(diào)控作用。甲狀腺激素受體TR是配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，屬類固醇類核受體超家族成員，TR可特異性識(shí)別甲狀腺激素反應(yīng)元件（TREs）序列，通過(guò)與TREs結(jié)合，TR激活或抑制下游靶基因轉(zhuǎn)錄。因此，研究牙鲆變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制

3、，揭示其甲狀腺激素基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)闡述牙鲆變態(tài)機(jī)理具有重大意義。 本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)GenBank登陸的牙鲆甲狀腺激素受體TRαA cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，其中上游引物加入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加入HindⅢ酶切位點(diǎn)，提取牙鲆仔魚頭部總RNA，通過(guò)RT-PCR獲得TRαA cDNA片段，將目的基因克隆至原核表達(dá)載體pET-30a上，雙酶切鑒定正確后進(jìn)行DNA測(cè)序，構(gòu)建了牙鲆甲狀腺激素受體TRαA原核表達(dá)載體pET-30a-

4、TRαA。挑選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化基因工程大腸桿菌BL21（DE3），雙酶切鑒定后，挑取陽(yáng)性用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白TRαA，成功表達(dá)了38kD大小的重組蛋白TRαA，進(jìn)行目的蛋白表達(dá)的可溶性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其以包涵體形式存在，包涵體變性后利用原核表達(dá)載體pET-30aN端的His-Tag采用金屬螯合層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，得到了純度較高的目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析該蛋白純度達(dá)到了95％，并對(duì)重

5、組蛋白成功的進(jìn)行了復(fù)性，Western Blot檢測(cè)鑒定表達(dá)產(chǎn)物。蛋白經(jīng)復(fù)性后皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭家兔，經(jīng)4次免疫后，頸動(dòng)脈采血制備抗TRαA的多克隆抗體，通過(guò)Dot Blot印跡檢測(cè)抗體效價(jià)，在抗體稀釋度為1：200000時(shí)仍出現(xiàn)陽(yáng)性斑點(diǎn)著色，說(shuō)明抗體的效價(jià)達(dá)到1：200000以上，表達(dá)的重組蛋白TRαA具有良好的免疫原性，制備的多克隆抗體對(duì)于識(shí)別表達(dá)的重組蛋白TRαA具有較好的特異性。親和層析法純化特異性抗體。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀技

6、術(shù)，鑒定在活體細(xì)胞中多克隆抗體與TRαA的特異性結(jié)合，根據(jù)牙鲆堿性磷酸酶基因（ALP）5’調(diào)控區(qū)甲狀腺激素應(yīng)答元件（TRE）序列設(shè)計(jì)特異性引物，以ChIP-DNA為模板，PCR擴(kuò)增ALP基因啟動(dòng)子區(qū)TRE結(jié)合位點(diǎn)。成功擴(kuò)增了牙鲆堿性磷酸酶基因（ALP）5’調(diào)控區(qū)甲狀腺激素應(yīng)答元件（TRE）結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果提供了甲狀腺激素通過(guò)其受體在體內(nèi)參與堿性磷酸酶基因（ALP）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的依據(jù)。 本研究工作為今后進(jìn)一步研究甲狀腺激素調(diào)控的分子機(jī)