樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化中的作用.pdf

1、2型糖尿病和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)關(guān)系密切。冠心病是2型糖尿病最主要的大血管并發(fā)癥和重要的致死、致殘?jiān)蛑唬?型糖尿病則是冠心病的主要危險(xiǎn)因素。最近研究發(fā)現(xiàn)，更是高達(dá)213的冠心病患者合并高血糖或糖耐量異常；糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化不但發(fā)生早、受累病變范圍廣、病變程度重，而且多為伴出血和潰瘍的復(fù)合斑塊；至今糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來(lái)，炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受

2、到關(guān)注。其炎癥免疫理論的核心是：在動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，抗原如氧化修飾的脂蛋白的刺激下，激活T淋巴細(xì)胞所引起的一系列特異性細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，進(jìn)一步激活效應(yīng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、血小板和平滑肌細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎性產(chǎn)物的暴增，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和斑塊的破裂。既往研究多集中在炎癥免疫的效應(yīng)細(xì)胞如單核一巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，而T淋巴細(xì)胞激活首先需要抗原遞呈，隨著體內(nèi)最重要的抗原呈遞和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞-樹(shù)突狀細(xì)胞(dendri

3、tic cells，DCs)在血管組織中的發(fā)現(xiàn)，DCs在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。而2型糖尿病患者獨(dú)特的體內(nèi)微環(huán)境可能通過(guò)DCs觸動(dòng)和放大這種炎癥和免疫反應(yīng)，從而促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，這可能是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生早、程度重、預(yù)后差的重要原因之一。的確，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，作為一種抗原，糖尿病患者體內(nèi)的糖基化終產(chǎn)物可通過(guò)促進(jìn)DCs分化成熟參與并放大動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)。 因此，本項(xiàng)研究的目的是：進(jìn)一

4、步探討DCs參與的炎癥免疫反應(yīng)在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。全文由二個(gè)部分組成：(1)以單核源性DCs作為研究對(duì)象，體外選擇糖尿病患者最重要的臨床特征一高血糖為干預(yù)因素，以期探討高糖通過(guò)DCs促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的可能機(jī)制：(2)觀察臨床2型糖尿病合并與不合并冠心病患者循環(huán)中DCs及其亞型漂移情況，探討該類人群的異常免疫學(xué)特征，不僅對(duì)揭示糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的病理發(fā)生具有重要的意義，為其研究及防治提供新理論、新視角和新靶點(diǎn)，也為將來(lái)2型糖

5、尿病合并冠心病的分子預(yù)測(cè)提供新的思路。 第一部分：高糖對(duì)人單核細(xì)胞源樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟和免疫功能的影響及其機(jī)制研究目的：探討高糖對(duì)人單核細(xì)胞源的樹(shù)突狀細(xì)胞(monocyte derived dendriticcells．MDCs)分化、成熟及其免疫功能的影響，進(jìn)一步探索高糖在動(dòng)脈粥樣硬化免疫炎癥反應(yīng)中的作用。 方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，在含重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF，100ng/ml)和重組人白

6、細(xì)胞介素-4(rhlL-4，20ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；不成熟MDCs在含有5.5mmol/L D-葡萄糖、25mmol/L D-葡萄糖、5.5mmol/L D-葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇、25mmol/L D-葡萄糖+30mmol/LN-乙酰半胱氨酸(N-acetyleysteine，NAC)及25mmol/L D-葡萄糖+10pmol/LSB203580(p38 MAPK阻斷劑)的RPM11640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)

7、48小時(shí)后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDCs表型；以MDC為刺激細(xì)胞、同種異體T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞按比例混合后，以混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度觀察對(duì)DCs抗原遞呈和淋巴細(xì)胞增殖的影響；E LISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子濃度：利用熒光探針還原型二氯熒光素(2',7’-dichlorodihydrofluorescin，DCFH)在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)MDC內(nèi)活性氧水平(reactive oxygen species，ROS)；蛋白免疫印跡法檢測(cè)p38

8、 MAPK磷酸化水平。 結(jié)果：與正常對(duì)照比，25mmol/L葡萄糖明顯增強(qiáng)MDC內(nèi)ROS水平(P<0.01)，顯著上調(diào)MDC表面標(biāo)志CD86，CD83，CD1a，HLA-DR表達(dá)、增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖作用(P<0.01)并且促進(jìn)MDC分泌細(xì)胞因子lFN-Y、IL-10、IL-12和IL-2(P<0.05)；同時(shí)，p38 MAPK磷酸化水平顯著增高；而氧自由基清除積劑NAC及p38 MAPK阻斷劑SB203580可部分阻斷高糖的上述

9、作用。 結(jié)論：高糖通過(guò)增強(qiáng)DCs內(nèi)ROS生成及p38 MAPK活性從而促進(jìn)DCs成熟、激活T淋巴細(xì)胞的能力也明顯增強(qiáng)，并且通過(guò)促進(jìn)DCs本身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應(yīng)。這可能是DCs參與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生的重要機(jī)制之一。 第二部分：2型糖尿病合并與不合并冠心病患者循環(huán)樹(shù)突狀細(xì)胞亞型漂移的研究 目的：樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)參與的炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。DCs的

10、兩個(gè)亞型，髓樣DC(mDC)和漿細(xì)胞樣DC(pDC)是重要抗原遞呈和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。我們假設(shè)：與單純2型糖尿病者比，2型糖尿病合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者體內(nèi)存在著異常的免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為循環(huán)DCs及亞型比例的改變。 方法：24例2型糖尿病患者，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影(CAG)檢查或，和<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層心肌灌注顯像分為單純糖尿病組(n=11)和糖尿病合并冠心病組(n=13)，以年齡匹

11、配的健康成人作對(duì)照(n=16)。采用流式細(xì)胞儀三色分析方法測(cè)定其外周循環(huán)中DCs及其亞型的百分比和絕對(duì)數(shù)。其中DCs以Lin1<'->HLA-DR<'+>確定，mDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD11c<'+>確定，pDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD123<'+>確定；ELISA法檢測(cè)外周血IL-6、hs-CRP和TNF-α水平，與mDC、pDC數(shù)量及mDC/pDC比值做相關(guān)性分析。 結(jié)果：與正常對(duì)照相

12、比，單純2型糖尿病患者循環(huán)的DCs及亞型的總數(shù)和百分比沒(méi)有顯著改變；而糖尿病合并冠心病組DCs總數(shù)、百分比與單純糖尿病組比顯著減少(絕對(duì)數(shù)：1.57±0.32×10<'7>/L vs 1.19±0.54×10<'7>/L，p=0.045;百分比：0.22±0.05％vs．0.17±0.07％。p=0.029)：mDC的比例和絕對(duì)數(shù)也明顯降低(絕對(duì)數(shù)：1.31±0.29×10<'7>/L vs．0.91±0.44×10<'7>/L，p=0

13、．0281百分比：0.19±0.05％vs.0.13±0.06％．p=0.017)，而pDC百分比和絕對(duì)值未見(jiàn)明顯差別(百分比：0.05±0.02％ vs．0.04±0.03％，p>0.05；絕對(duì)數(shù)：0.33±0.19×10<'7>/L MS．0.28+0.18×10<'7>/L，p=0.601)；mDC/pDC比值有降低的趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.283)，進(jìn)一步分析糖尿病合并不穩(wěn)定性冠心病(DM+UAP)mDC/pDC比值發(fā)現(xiàn)

14、，與正常對(duì)照和單純糖尿病組比，DM+UAP患者mDC/pDC比值明顯下降(p=0.022 vs Normal；p=0.047 vs DM)。mDC數(shù)量與患者血清TNF-α(r=-0.716．p<0.001)、hs-CRP(r=-0.750，p<0.001)及病變血管數(shù)目(r=-0 633．p=0.020)呈顯著負(fù)相關(guān)，與IL-6無(wú)明顯相關(guān)性(p>0.05)；pDC數(shù)量與hs-CRP、IL-6、TNF-α及病變血管數(shù)目無(wú)明顯相關(guān)性。mDC

15、/pDC與TNF-α(r-=-0.518。p=0.010)、hs-CRP(r=-0.369，p=0.019)和病變血管數(shù)目(r=-0.924，p<0.001)亦呈顯著負(fù)相關(guān)，而與IL-6無(wú)明顯相關(guān)性。 結(jié)論：與單純2型糖尿病者比，糖尿病合并冠心病者循環(huán)的DCs顯著減少，且DCs存在著亞型漂移，以mDC減少為主；mDC的減少程度、mDC/pDC比值降低與冠心病病變的彌漫程度及穩(wěn)定性有關(guān)。這種遷移性改變可能反映了糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化斑