樹突狀細胞介導的炎癥免疫反應(yīng)在糖尿病動脈粥樣硬化中的作用.pdf

1、2型糖尿病和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)關(guān)系密切。冠心病是2型糖尿病最主要的大血管并發(fā)癥和重要的致死、致殘原因之一；2型糖尿病則是冠心病的主要危險因素。最近研究發(fā)現(xiàn)，更是高達213的冠心病患者合并高血糖或糖耐量異常；糖尿病患者動脈粥樣硬化不但發(fā)生早、受累病變范圍廣、病變程度重，而且多為伴出血和潰瘍的復合斑塊；至今糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病機制尚不完全清楚。近年來，炎癥免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化及糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受

2、到關(guān)注。其炎癥免疫理論的核心是：在動脈粥樣硬化的危險因素，抗原如氧化修飾的脂蛋白的刺激下，激活T淋巴細胞所引起的一系列特異性細胞免疫及體液免疫反應(yīng)，進一步激活效應(yīng)細胞，如巨噬細胞、血小板和平滑肌細胞，從而導致炎性產(chǎn)物的暴增，促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和斑塊的破裂。既往研究多集中在炎癥免疫的效應(yīng)細胞如單核一巨噬細胞、平滑肌細胞和T淋巴細胞，而T淋巴細胞激活首先需要抗原遞呈，隨著體內(nèi)最重要的抗原呈遞和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細胞-樹突狀細胞(dendri

3、tic cells，DCs)在血管組織中的發(fā)現(xiàn)，DCs在動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。而2型糖尿病患者獨特的體內(nèi)微環(huán)境可能通過DCs觸動和放大這種炎癥和免疫反應(yīng)，從而促使動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，這可能是糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生早、程度重、預(yù)后差的重要原因之一。的確，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，作為一種抗原，糖尿病患者體內(nèi)的糖基化終產(chǎn)物可通過促進DCs分化成熟參與并放大動脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)。 因此，本項研究的目的是：進一

4、步探討DCs參與的炎癥免疫反應(yīng)在糖尿病動脈粥樣硬化中的作用。全文由二個部分組成：(1)以單核源性DCs作為研究對象，體外選擇糖尿病患者最重要的臨床特征一高血糖為干預(yù)因素，以期探討高糖通過DCs促進動脈粥樣硬化發(fā)生的可能機制：(2)觀察臨床2型糖尿病合并與不合并冠心病患者循環(huán)中DCs及其亞型漂移情況，探討該類人群的異常免疫學特征，不僅對揭示糖尿病動脈粥樣硬化的病理發(fā)生具有重要的意義，為其研究及防治提供新理論、新視角和新靶點，也為將來2型糖

5、尿病合并冠心病的分子預(yù)測提供新的思路。 第一部分：高糖對人單核細胞源樹突狀細胞分化成熟和免疫功能的影響及其機制研究目的：探討高糖對人單核細胞源的樹突狀細胞(monocyte derived dendriticcells．MDCs)分化、成熟及其免疫功能的影響，進一步探索高糖在動脈粥樣硬化免疫炎癥反應(yīng)中的作用。 方法：分離人外周血單個核細胞，在含重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF，100ng/ml)和重組人白

6、細胞介素-4(rhlL-4，20ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；不成熟MDCs在含有5.5mmol/L D-葡萄糖、25mmol/L D-葡萄糖、5.5mmol/L D-葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇、25mmol/L D-葡萄糖+30mmol/LN-乙酰半胱氨酸(N-acetyleysteine，NAC)及25mmol/L D-葡萄糖+10pmol/LSB203580(p38 MAPK阻斷劑)的RPM11640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)

7、48小時后，采用流式細胞術(shù)檢測MDCs表型；以MDC為刺激細胞、同種異體T淋巴細胞為反應(yīng)細胞按比例混合后，以混合淋巴細胞反應(yīng)強度觀察對DCs抗原遞呈和淋巴細胞增殖的影響；E LISA法檢測細胞培養(yǎng)上清細胞因子濃度：利用熒光探針還原型二氯熒光素(2',7’-dichlorodihydrofluorescin，DCFH)在共聚焦顯微鏡下檢測MDC內(nèi)活性氧水平(reactive oxygen species，ROS)；蛋白免疫印跡法檢測p38

8、 MAPK磷酸化水平。 結(jié)果：與正常對照比，25mmol/L葡萄糖明顯增強MDC內(nèi)ROS水平(P<0.01)，顯著上調(diào)MDC表面標志CD86，CD83，CD1a，HLA-DR表達、增強T淋巴細胞增殖作用(P<0.01)并且促進MDC分泌細胞因子lFN-Y、IL-10、IL-12和IL-2(P<0.05)；同時，p38 MAPK磷酸化水平顯著增高；而氧自由基清除積劑NAC及p38 MAPK阻斷劑SB203580可部分阻斷高糖的上述

9、作用。 結(jié)論：高糖通過增強DCs內(nèi)ROS生成及p38 MAPK活性從而促進DCs成熟、激活T淋巴細胞的能力也明顯增強，并且通過促進DCs本身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應(yīng)。這可能是DCs參與糖尿病動脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生的重要機制之一。 第二部分：2型糖尿病合并與不合并冠心病患者循環(huán)樹突狀細胞亞型漂移的研究 目的：樹突狀細胞(DCs)參與的炎癥免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中起著重要作用。DCs的

10、兩個亞型，髓樣DC(mDC)和漿細胞樣DC(pDC)是重要抗原遞呈和免疫調(diào)節(jié)細胞。我們假設(shè)：與單純2型糖尿病者比，2型糖尿病合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者體內(nèi)存在著異常的免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為循環(huán)DCs及亞型比例的改變。 方法：24例2型糖尿病患者，經(jīng)冠狀動脈造影(CAG)檢查或，和<'99m>Tc-甲氧基異丁基異腈(MIBI)單光子發(fā)射計算機斷層心肌灌注顯像分為單純糖尿病組(n=11)和糖尿病合并冠心病組(n=13)，以年齡匹

11、配的健康成人作對照(n=16)。采用流式細胞儀三色分析方法測定其外周循環(huán)中DCs及其亞型的百分比和絕對數(shù)。其中DCs以Lin1<'->HLA-DR<'+>確定，mDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD11c<'+>確定，pDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD123<'+>確定；ELISA法檢測外周血IL-6、hs-CRP和TNF-α水平，與mDC、pDC數(shù)量及mDC/pDC比值做相關(guān)性分析。 結(jié)果：與正常對照相

12、比，單純2型糖尿病患者循環(huán)的DCs及亞型的總數(shù)和百分比沒有顯著改變；而糖尿病合并冠心病組DCs總數(shù)、百分比與單純糖尿病組比顯著減少(絕對數(shù)：1.57±0.32×10<'7>/L vs 1.19±0.54×10<'7>/L，p=0.045;百分比：0.22±0.05％vs．0.17±0.07％。p=0.029)：mDC的比例和絕對數(shù)也明顯降低(絕對數(shù)：1.31±0.29×10<'7>/L vs．0.91±0.44×10<'7>/L，p=0

13、．0281百分比：0.19±0.05％vs.0.13±0.06％．p=0.017)，而pDC百分比和絕對值未見明顯差別(百分比：0.05±0.02％ vs．0.04±0.03％，p>0.05；絕對數(shù)：0.33±0.19×10<'7>/L MS．0.28+0.18×10<'7>/L，p=0.601)；mDC/pDC比值有降低的趨勢，但未見統(tǒng)計學差異(P=0.283)，進一步分析糖尿病合并不穩(wěn)定性冠心病(DM+UAP)mDC/pDC比值發(fā)現(xiàn)

14、，與正常對照和單純糖尿病組比，DM+UAP患者mDC/pDC比值明顯下降(p=0.022 vs Normal；p=0.047 vs DM)。mDC數(shù)量與患者血清TNF-α(r=-0.716．p<0.001)、hs-CRP(r=-0.750，p<0.001)及病變血管數(shù)目(r=-0 633．p=0.020)呈顯著負相關(guān)，與IL-6無明顯相關(guān)性(p>0.05)；pDC數(shù)量與hs-CRP、IL-6、TNF-α及病變血管數(shù)目無明顯相關(guān)性。mDC

15、/pDC與TNF-α(r-=-0.518。p=0.010)、hs-CRP(r=-0.369，p=0.019)和病變血管數(shù)目(r=-0.924，p<0.001)亦呈顯著負相關(guān)，而與IL-6無明顯相關(guān)性。 結(jié)論：與單純2型糖尿病者比，糖尿病合并冠心病者循環(huán)的DCs顯著減少，且DCs存在著亞型漂移，以mDC減少為主；mDC的減少程度、mDC/pDC比值降低與冠心病病變的彌漫程度及穩(wěn)定性有關(guān)。這種遷移性改變可能反映了糖尿病動脈粥樣硬化斑