兩型TNF-α對荷瘤小鼠MDSC免疫抑制功能的影響.pdf

1、髓系來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是未分化成熟的、異質性的、具有免疫抑制功能的髓系細胞群體。腫瘤組織中被證實有MDSC的大量聚集，該群細胞通過抑制腫瘤免疫，而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。多種腫瘤組織來源的炎性因子如IL-1 β、IL-6、PGE2、VEGF等參與MDSC的誘導和募集，腫瘤壞死因子（Tumornecrosis factor，TNF-α）作為促炎細胞因子，在腫瘤微環(huán)境中

2、，被廣泛表達于腫瘤相關巨噬細胞（TAM)、腫瘤細胞和腫瘤間質細胞，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但迄今為止，TNF-α對MDSCs的影響尚不清楚。本研究旨在探討跨膜型和分泌型TNF-α(tmTNF-α和sTNF-α）對腫瘤MDSC 免疫抑制功能的影響及其分子機制，為腫瘤治療提供新線索。主要結果如下：
　　 第一部 體外兩型TNF-α對荷瘤小鼠MDSCs 功能的影響
　　 用Percoll 密度梯度離心法和Gr-1 抗

3、體包被的磁珠分離純化荷瘤小鼠脾臟細胞的MDSCs，經(jīng)流式細胞術鑒定其純度達95％以上。
　　 一、荷瘤小鼠MDSC 自身TNF-α和TNFR的表達
　　 用RT-PCR的方法和流式細胞術分別從mRNA 水平和蛋白質水平檢測MDSC 自身TNF-α和TNFR的表達。結果表明：無論在mRNA 水平還是在蛋白質水平，荷瘤小鼠MDSCs表達的TNF-α和兩型TNFR 均明顯高于正常小鼠的MDSCs(p<0.05），且以TNFR2

4、表達為主。
　　 二、體外兩型TNF-α對荷瘤小鼠MDSCs 功能的影響
　　 1.外源性tmTNF-α促進MDSCs 轉錄 iNOS mRNA及分泌NO ：用兩型TNF-α刺激荷瘤小鼠MDSCs 16 h，結果顯示sTNF-α明顯抑制MDSC 轉錄iNOS mRNA和分泌NO(p<0.05），而tmTNF-α則明顯促進MDSC 轉錄iNOS mRNA(約1.6倍）和釋放NO(約2.5倍）。當用抗體中和tmTNF-α后，

5、iNOS mRNA和NO的水平恢復至對照的基礎水平。
　　 2.兩型TNF-α均可促進MDSCs 轉錄ARG1 mRNA ：采用real-time PCR 技術觀察兩型TNF-α對MDSCs 轉錄ARG1 mRNA的影響，結果顯示：sTNF-α明顯增加MDSCs的ARG1 mRNA 水平（約4倍）（P<0.05），而tmTNF-α則輕度提高ARG1 mRNA 水平（約1.5倍）。
　　 31.兩型TNF-α對MDSCs分

6、泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β的影響：采用ELISA法比較兩型TNF-α對MDSCs分泌IL-10和TGF-β的影響。結果顯示：tmTNF-α可明顯促進MDSC分泌IL-10和TGF-β（P<0.01），而sTNF-α則僅能刺激MDSC分泌TGF-β，對其產(chǎn)生IL-10 則無影響。
　　 41.tmTNF-α可促進MDSCs 抑制T 細胞增殖
　　 由于tmTNF-α對MDSC的刺激作用明顯高于sTNF-α，故我

7、們進一步觀察用tmTNF-α刺激MDSCs的培養(yǎng)上清是否能夠有效抑制PMA和Ionomycin 聯(lián)合誘導的T細胞增殖。結果顯示：MDSC 培養(yǎng)上清可明顯抑制T 細胞增殖（抑制率50％），而經(jīng)tmTNF-α刺激的MDSCs 培養(yǎng)上清的抑制作用明顯增強（抑制率80％），該促進作用可被TNF 抗體或IL-10 抗體完全阻斷。該結果充分提示：tmTNF-α能通過促進MDSCs分泌IL-10等抑制性細胞因子，增強MDSCs 對T 細胞增殖的抑制作

8、用。
　　 三、tmTNF-α促進MDSCs 發(fā)揮免疫抑制作用的分子機制
　　 1.tmTNF-α通過誘導p38 磷酸化促進MDSCs的抑制功能：用Western blotting 觀察兩型TNF-α對荷瘤小鼠MDSCs的MAPK 家族中信號分子的影響。結果顯示：兩型TNF-α對MDSC的ERK和JNK 磷酸化水平均無明顯影響，但可促進p38 磷酸化，其中tmTNF-α的刺激作用明顯強于sTNF-α，用抗體中和tmTNF

9、-α可完全阻斷其作用。提示tmTNF-α對MDSC的促進作用可能與p38 通路相關。用p38 特異性抑制劑SB203580 預處理MDSCs，可完全阻斷tmTNF-α對p38磷酸化的刺激作用，進而封閉tmTNF-α對MDSC分泌IL-10及抑制T 細胞增殖的促進作用。
　　 2.tmTNF-α通過誘導NF-κB活化增強MDSCs的免疫抑制作用
　　 由于tmTNF-α可促進iNOS mRNA的轉錄，而該基因是NF-κB的

10、靶基因。因此，我們進而觀察兩型TNF-α對荷瘤小鼠MDSCs的NF-κB活化的影響。結果顯示：兩型TNF-α對NF-κB活化均有促進作用，但tmTNF-α的作用強于sTNF-α，即tmTNF-α可明顯促進MDSC的IκBα降解和NF-κB p65的核轉位；用抗體中和tmTNF-α可完全阻斷該分子的促進作用。提示tmTNF-α對MDSC的促進作用可能與NF-κB通路相關。
　　 用NF-B 抑制劑PDTC 預先處理MDSCs，可完

11、全阻斷tmTNF-α誘導的IκBα降解和NF-κB p65的核轉位，進而封閉tmTNF-α對MDSC分泌IL-10及抑制T 細胞增殖的促進作用。
　　 第二部分 體內兩型TNF-α對MDSCs 促腫瘤生長的影響
　　 一、建立穩(wěn)定表達兩型TNF-α的4T1 細胞株
　　 1.構建wt-TNF-α、sTNF-α突變體和tmTNF-α突變體真核表達質粒：為研究不同類型TNF-α在體內對MDSCs 遷移、募集和功能的影

12、響，我們采用分子克隆方法分別構建了小鼠wt-TNF-α、sTNF-α突變體和tmTNF-α突變體真核表達質粒，經(jīng)PCR/酶切、DNA測序等手段證明各載體構建成功。
　　 2.建立穩(wěn)定轉染各型TNF-α的4T1 乳腺癌細胞株：用脂質體將空質粒和上述插入有小鼠各型TNF-α的真核表達質粒分別轉染小鼠乳腺癌細胞4T1，經(jīng)G418 選擇性培養(yǎng)，獲取穩(wěn)轉細胞株。采用Western blot、FACS、ELISA等技術鑒定，證實穩(wěn)定表達wt

13、TNF-α的4T1 細胞株（4T1/wtTNF-α）可表達25kD tmTNF-α和17kD sTNF-α，既可在細胞表面可檢測到膜分子，也可在培養(yǎng)上清中可檢測到可溶性分子；穩(wěn)定表達tmTNF-α突變體的4T1 細胞株（4T1/tmTNF-α）只能檢測到細胞表面的膜分子，卻檢測不到上清中的分泌分子，細胞裂解液中僅有tmTNF-α(25kD）存在；穩(wěn)定表達sTNF-α突變體的4T1 細胞株（4T1/sTNF-α）只能檢測到上清中的分泌分子

14、，卻不能檢測到細胞表面的膜分子，細胞裂解液中僅有17kD sTNF-α存在。
　　 二、體內兩型TNF-α對MDSCs 促腫瘤生長的影響
　　 1.tmTNF-α促進腫瘤生長：分別接種4T1/neo(空載）、4T1/sTNF-α、4T1/wtTNF-α和4T1/tmTNF-α的細胞于BALB/c小鼠乳房的肪墊下，結果顯示：表達tmTNF-α的腫瘤生長速度較其他各組顯著加快，其腫瘤體積均顯著高于其他各組；而表達 sTNF-

15、α的腫瘤生長速度最慢，且腫瘤體積最小。該結果提示：腫瘤細胞高水平表達tmTNF-α可促進腫瘤生長，而高表達sTNF-α則可抑制腫瘤生長。
　　 2.tmTNF-α增強腫瘤組織中 MDSCs 募集，減少CD4+T和CD8+T 細胞的浸潤：取上述各組接種3周的腫瘤組織，用流式細胞術和免疫組化觀察MDSCs和淋巴細胞在腫瘤組織中的浸潤。結果顯示，表達tmTNF-α的腫瘤組織中MDSCs 浸潤最高，可達29.76％，但CD4 +和CD8

16、 +細胞聚集最少；表達 wtTNF-α或sTNF-α腫瘤組織MDSCs的聚集均低于對照組，但CD4 +和CD8 +細胞聚集增多，其中sTNF-α腫瘤最為明顯。
　　 31.tmTNF-α促進腫瘤組織釋放NO、IL-10和TGF-β
　　 取上述各組接種3周的腫瘤組織，鋪于細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h后，收集各組培養(yǎng)上清，檢測NO、IL-10和TGF-β水平。結果顯示：tmTNF-α可明顯促進腫瘤組織釋放NO(3.5倍，P<0.

17、01）、IL-10(1.5倍，P<0.05）和TGF-β（6.5倍，P<0.05）；而sTNF-α和 wtTNF-α則無影響。
　　 結論：（1）兩型TNF-α中，主要是tmTNF-α可在體外促進荷瘤小鼠MDSC 釋放NO、IL-10和TGF-，并增強MDSC 抑制T 細胞增殖的功能；（2）tmTNF-α可能通過激活NF-κ B 途徑和p38 途徑，促進 MDSC 產(chǎn)生IL-10等抑制性細胞因子，從而增強MDSC的免疫抑制功能；