蛋白質組學及相關分析技術研究曲馬多誘導斑馬魚腦氧化應激和依賴性潛力的關鍵蛋白質.pdf

1、鹽酸曲馬多(Tramadol hydrochloride，TH)作為一種非麻醉性中樞鎮(zhèn)痛藥，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最廣泛使用的處方藥。關于曲馬多在脊椎動物中的積極作用的報導曾經(jīng)一直占據(jù)主導地位，包括緩解中度至重度疼痛、抗抑郁、抗炎和免疫刺激作用、排尿控制、降低糖尿病癥體內(nèi)的血糖濃度等。然而，近年來曲馬多濫用中毒、不良反應和依賴性的市場監(jiān)測報告和臨床案例卻日益增多，而濫用相關的神經(jīng)毒性、功能障礙和依賴性潛力的細胞和分子水平機理的研究報道卻極少

2、。因而，迫切需要從分子和細胞水平對曲馬多濫用可能造成的依賴性潛力和神經(jīng)毒性等進行微觀分析。 本論文選用斑馬魚(Danio rerio)為研究對象，從行為學角度觀察和統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，曲馬多急性處理增加魚對氧的需求量和對富氧的水體表層的偏好性，從而顯著增大表層的魚平均分布密度。與毒麻類強鎮(zhèn)痛藥-杜冷丁陽性對照組相比同樣存在顯著差異，曲馬多處理組的這些異常現(xiàn)象不僅出現(xiàn)的更迅速，且持續(xù)時間更長(整個過程長達6h)，并伴隨著魚運動活力的下降，屬

3、于斑馬魚對曲馬多特有的異常行為和生理反應。含曲馬多飼料的長期投喂，則會造成斑馬魚體重和腦重量平均值的下降。這些獨特異常的生理反應，使斑馬魚成為研究曲馬多藥物毒性和藥物依賴性分子機理理想的動物模型。 與其他阿片類藥物類似，曲馬多引起SOD酶活力下降和脂質過氧化物含量的增加，表現(xiàn)出氧化強化劑特性；而慢性誘導過程中的抗氧化酶活性變化規(guī)律表明，斑馬魚對曲馬多的氧化毒性產(chǎn)生一定的適應性和耐受性。氣相色譜質譜聯(lián)用分析技術(GC/MS)跟蹤檢

4、測，單劑量肌注給藥后的魚腦、眼、鰓、心、肝、腸、肌等7種組織中曲馬多分布和清除情況；而繪制的原藥含量隨時間變化趨勢圖則顯示出，曲馬多在魚腦內(nèi)經(jīng)歷了一個快速分布和緩慢清除的過程。進一步從魚腦組織中檢測出兩種主要去甲基代謝物，即O-去甲基曲馬多(M1)和N-去甲基曲馬多(M2)，其中M2的含量明顯高于M1，為主要去甲基代謝物。因而肌注給藥途徑和GC/MS分析技術，適合于研究曲馬多在魚體內(nèi)的分布、清除、代謝和藥效，尤其是神經(jīng)毒性機理；進一步結

5、合SOD酶活性和MDA含量測定結果，即可以評估腦組織氧化應激程度，還可以為合適的給藥劑量的選擇和后續(xù)的蛋白質組學技術篩選和鑒定關鍵蛋白質的實驗樣品的準備提供科學的參考價值。 蛋白質組學是目前從組織器官中篩選與鑒定差異蛋白質的最佳分析技術之一。作者建立了一套適用于篩選和鑒定斑馬魚腦組織中的差異蛋白質的蛋白質組學研究方案。尤其是半定量雙向凝膠電泳技術的建立和質譜鑒定前的樣品準備中人血清轉鐵蛋白、白蛋白、鐵蛋白等蛋白添加劑或石蠟油、甘

6、油、凡士林等黏合劑作為肽質量指紋質譜鑒定的輔助增強劑的發(fā)現(xiàn)，都有效地提高了差異蛋白鑒定的靈敏度和可信度。曲馬多誘導差異表達的30個蛋白質斑點經(jīng)鑒定后，歸為13種蛋白，其中14-3-3蛋白、肌酸激酶(CK BB)、ATP合成酶(H+轉運，線粒體F1復合體，beta亞基)和微管蛋白等在不同的凝膠位置，分別檢出3、3、4和11種亞型；按蛋白功能分為六大類：細胞骨架、能量代謝、信號傳導、突觸功能、蛋白降解和修飾、鈣信號調(diào)節(jié)。多數(shù)蛋白是參與氧化應

7、激或氧化應激相關疾病發(fā)病機理的重要蛋白，例如：14-3-3蛋白，CK BB，泛素羧基端水解酶-L1(UCHL-1)，ATP合成酶，突觸體相關蛋白(SNAP)，微管蛋白，肌動蛋白等；而蛋白：醛縮酶C，ATP合成酶，CK BB，丙酮酸脫氫酶激酶，UCHL-1，14-3-3蛋白，dynamin1，SNAP，微管蛋白，肌動蛋白等則屬于多種藥物依賴相關的共同蛋白。同時也發(fā)現(xiàn)了一些尚未報導的新蛋白，例如：鈣信號調(diào)節(jié)相關蛋白novel protein

8、 similar to vertebrate EF hand calcium binding protein2，結構相關蛋白novel intermediate filament protein，similar to centrosomal protein110 kDa。曲馬多同已知的依賴性藥物一樣主要通過三種普遍認可的途徑引發(fā)神經(jīng)毒性，即能量代謝、氧化應激和蛋白降解、修飾。 Western blotting和酶活性分析表明，

9、曲馬多慢性誘導上調(diào)14-3-3 epsilon蛋白表達量，和抑制酶縮酶和肌酸激酶(能量系統(tǒng)中的兩種重要酶)活性，且此類影響一直維持到撤藥后兩周仍十分顯著。相關結果進一步驗證了蛋白質組學技術篩選和鑒定的曲馬多誘導的差異蛋白的可信度。曲馬多慢性誘導引起多種與氧化應激和能量代謝密切相關的重要蛋白質的表達量下調(diào)，而這些蛋白的差異表達都直接或間接的涉及線粒體結構和功能的改變。曲馬多慢性處理后的線粒體超微結構觀察顯示，線粒體分布紊亂，數(shù)目顯著下降，

10、基質變稀。電子密度下降，出現(xiàn)腫脹、空泡樣，線粒體嵴數(shù)目減少、斷裂甚至是缺失等一系列與結構和功能障礙密切相關的形態(tài)學變化。 基于行為學、藥物代謝、免疫印跡、酶學測定和超微結構觀察等多種手段輔助下的蛋白質組學及其相關技術篩選和鑒定曲馬多誘導的斑馬魚腦組織氧化應激關鍵蛋白的結果，從細胞和分子水平揭示了曲馬多長期濫用導致腦組織氧化應激、線粒體損傷和蛋白修飾或降解相關的神經(jīng)毒性，以及引起能量系統(tǒng)失衡、細胞骨架破壞等，且很可能存在依賴性潛力